抑制泛素羧基末端水解酶L1对小鼠心肌纤维化的影响

龚 峥，马礼坤，叶 青，周俊岭，孔祥勇

心肌纤维化是心肌因压力超负荷、缺血损伤或代谢应激引起的严重病理表现，是多种心脏疾病的最终进展结果，其病理学特点是心肌间质胶原的异常沉积，心肌条索化最终瘢痕形成。抑制心肌纤维化对改善心血管系统疾病的预后降低病死率具有重大意义。心肌纤维化的原因复杂，心肌纤维化发生、发展的机制不清楚。心肌纤维化是一个急需解决的临床问题。

泛素-蛋白酶体系统是生物细胞内蛋白质降解的主要途径，对维持细胞内蛋白质稳态，控制生命活动有重大意义。其中泛素羧基末端水解酶 L1(UCH-L1)是去泛素化酶家族的一个成员，UCH-L1在某些心脏疾病发生后的心肌细胞和成纤维细胞内都上调，所以UCH-L1上调可能在适应不良心脏重塑和功能障碍中有重要的病理学意义。但是UCH-L1在心肌纤维化进展中发挥什么样的作用和具体的分子机制目前尚无研究。

1 材料与方法

1.1 实验动物

C57BL/6雄性小鼠40只，体质量为(27±3)g，由中国科学技术大学动物实验中心提供，标准环境饲养，SPF级别。

1.2 主要试剂

UCH-L1特异性阻滞剂LDN57444购自美国APExBIO生物公司，外源性PDGF-DD购自美国 PeproThech公司，p-PDGFβ、PI3K、蛋白激酶B、p65兔单克隆抗体购自美国Bioworld公司。

1.3 方法

1.3.1

实验分组及干预 随机将24只小鼠分为4组，消毒皮肤，水合氯醛腹腔麻醉，皮下植入微量缓释泵(Alzet胶囊缓释泵)持续给药，分别为sham组[0.9%氯化钠溶液1 000 ng/(kg·min)]；Ang Ⅱ组[血管紧张素Ⅱ 1 000 ng/(kg·min)；LDN组(sham+LDN组)腹腔注射LDN57444，40 μg/(kg·d)]；Ang Ⅱ+LDN组[血管紧张素Ⅱ 1 000 ng/(kg·min)，腹腔注射LDN57444，40 μg/(kg·d)]。小鼠均清洁饲养14 d，每天称重。

1.3.2

小鼠血压及心功能检测 Visitech BP-2000尾袖系统隔天同一时间测定小鼠尾动脉血压并记录。应用M-mode超声心动仪测定小鼠心脏结构和心功能变化，Vevo 2100系统行经胸骨旁短轴超声检查，连续分析至少5～8个心动周期并计算射血分数，左室内径，左室后壁厚度，室间隔厚度等指标。14 d后处死小鼠并取出心脏称重，计算心脏质量/体质量比值。

1.3.3

天狼猩红染色 第14天收集各组心脏组织用2%多聚甲醛在41 ℃下固定24 h，固定组织脱水，石蜡包埋，制作4 mm厚切片，然后苦味酸天狼猩红胶原染色法染色，心肌间质胶原面积与视野总面积的比值用于胶原沉积的定量测量。

1.3.4

原代心肌成纤维细胞分离培养 将1～2 d小鼠心脏差速贴壁法分离纯化CFs传至第3代，分为：对照组(细胞+培养基)、P组(细胞+培养基+20 ng/ml PDGF-DD)、 PL组(细胞+培养基+20 ng/ml PDGF-DD+40 μmol/L LDN57444)。培养基为含10%胎牛血清的HG/DMEM，培养条件为5% CO、37 ℃。

1.3.5

实时荧光定量PCR检测各组PI3K、AKT、IκB 、UCH-L1、Ⅰ型胶原蛋白的mRNA表达水平 取对数期生长的CFs接种到6孔板内，TRIzol法提取细胞内RNA，对各组样品目的基因进行扩增，引物序列见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.6

Western blot法检测各组PDGFRβ、p-PDGFRβ、pPI3K、PI3K、pAKT、AKT、UCH-L1、pRb、Rb、Col Ⅰ的蛋白表达水平 取对数期细胞分组后条件干预继续孵育24 h，PL组加入LDN57444预处理2 h。使用含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液裂解CFs，使用15%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，然后转移到PVDF膜上。在室温下，5%脱脂牛奶进行封闭1 h。加入一抗(1 ∶500)4 ℃摇床过夜，洗涤3次，每次10 min。加入二抗(1 ∶1 000)室温摇床孵育2 h，洗涤3次，每次10 min。所有蛋白用ECL试剂盒进行可视化。

1.3.7

染色质免疫共沉淀 TNF-α处理心肌成纤维细胞1 h，用磷酸盐缓冲的生理盐水洗涤2次，在37 ℃下用1%甲醛交联10 min，蛋白-DNA复合物用NF-κB p65抗体和正常兔IgG抗体免疫沉淀。纯化后得到DNA进行qRT-PCR分析。

2 结果

2.1 动物实验中UCHL1抑制剂处理后改善Ang Ⅱ诱导的小鼠心脏功能障碍

在灌注Ang Ⅱ前，各组小鼠收缩血压约14.23 kPa。Ang Ⅱ组小鼠2周后收缩血压增高，Ang Ⅱ+LDN组小鼠血压相对于Ang Ⅱ组没有变化。见图1。通过超声心动图测量结果显示Ang Ⅱ灌注14 d后Ang Ⅱ组小鼠射血分数(EF%)、室间隔厚度、左室后壁厚度和短轴缩短率(FS%)比Sham组增大，左室舒张内径比空白对照组减小，在Ang Ⅱ+LDN组的小鼠中相对于Ang Ⅱ组则降低，左室内径增大。见图2。说明抑制UCHL1可逆转Ang Ⅱ灌注诱导的小鼠心脏重构。

图1 各组小鼠尾监测的收缩压(n=6)

图2 各组小鼠超声心动图评价心脏结构和功能变化A：各组小鼠心脏彩超；B：射血分数；C：心脏质量体质量比；D：左心室短轴缩短指数；E：舒张期室间隔厚度；F：左室舒张期内径；G：舒张期左室后壁厚度；H：收缩期室间隔厚度；I：左室收缩期内径；J：收缩期左室后壁厚度；与Sham组比较：*P<0.05；与Sham+LDN组比较：#P<0.05

2.2 苦味酸天狼猩红染色心肌间质胶原测定

干预14 d后处死各组小鼠，取出心脏组织进行天狼猩红染色，心肌间质内胶原纤维呈红色，正常心肌组织呈黄色。结果显示Ang Ⅱ组心肌间质胶原含量最多，与Sham组相比，Ang Ⅱ+LDN组左心室切片天狼猩红染色显示心肌纤维化程度降低，差异有统计学意义(

F

=29.42，

P

<0.05)。见图3。

图3 天狼猩红染色分析小鼠左心室血管周围和心脏间质纤维化变化与Sham组比较：**P<0.01；与Sham+LDN组比较：#P<0.05

2.3 心肌成纤维细胞的生理学特性

经培养的心肌成纤维细胞90 min开始贴壁生长，培养24 h后CFs多呈梭形等形态，细胞排列紧密。培养至5代后，细胞逐渐开始衰老，细胞开始变大，增殖能力变弱，并可观察到多核细胞。分离纯化得到的CFs行波形蛋白免疫荧光染色阳性率>90%。见图4。

图4 光镜下原代心肌成纤维细胞形态及鉴定A：心肌成纤维细胞原代培养2代后荧光显微镜下观察波形蛋白免疫荧光染色×200，vimentin蛋白呈现红色荧光；B：细胞核DAPI染色×200；C：Merge

2.4 心肌成纤维细胞中各组荧光定量PCR检测结果

心肌成纤维细胞原代培养3代后，UCH-L1抑制剂LDN减轻PDGF-DD诱导的心肌纤维化，q-PCR进一步检测结果显示LDN组PI3K、AKT、IκB 、UCH-L1的mRNA水平相对于PDGF组没有降低，LDN组的Col Ⅰ的mRNA水平相对于PDGF组降低(

F

=13.67，

P

<0.05)。见图5。

图5 各组PI3K、AKT、IκB、UCH-L1的mRNA相对表达水平1：Vehicle组；2：PDGF-DD组；3：PDGF-DD+LDN组; 与Vehicle组比较：**P<0.01；与PDGF-DD组比较：#P<0.05

2.5 Western blot检测结果

Western blot结果显示LDN组UCH-L1的蛋白表达量相对于PDGF-DD组没有变化，检测PI3K/AKT信号通路中显示蛋白水平和磷酸化水平相对于Vehicle组增高，其中LDN组p-PDGFRβ/PDGFRβ、pPI3K/PI3K、pRB/RB、Col I的蛋白表达量相对于PDGF-DD组降低(

P

<0.05)。见图6。

图6 各组蛋白相对表达水平1：Vehicle组；2：PDGF-DD组；3：PDGF-DD+LDN组; 与Vehicle组比较：*P<0.05，**P<0.01；与PDGF-DD组比较：#P<0.05，##P<0.01

2.6 心肌成纤维细胞中加入NF-κB活化特异性抑制剂后UCH-L1蛋白表达水平

体外培养心肌成纤维细胞后给予20 ng/ml PDGF-DD诱导，继续培养48 h后加入不同浓度的NF-κB活化特异性抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸铵(PDTC)，Western blot法检测UCH-L1的蛋白表达量降低，差异有统计学意义(

F

=30.58，

P

<0.01)。见图7。

图7 在PDTC的不同浓度组UCH-L1蛋白的相对表达水平与Vehicle组比较：**P<0.01

2.7 染色质免疫共沉淀结果

TNF-α处理心肌成纤维细胞1 h后，分别加入p65抗体和对照IgG抗体沉淀后行PCR定量分析，使用引物扩增包含不同κB结合位点(KBS1和KBS2)的UCH-L1启动子DNA，通过实时PCR分析对共沉淀的DNA和相应的输入DNA进行定量，NF-κB的结合序列KBS1和KBS2调控下游UCH-L1的表达。见图8。

图8 UCH-L1基因的启动子区域存在NF-κB应答原件A：UCH-L1基因相关的转录起始位点NF-κB结合序列(KBS1和KBS2)的位置被示出，转录起始位点显示为线箭头；B：TNF-α处理1 h的细胞中加入抗p65抗体沉淀和对照IgG抗体沉淀染色质的定量PCR分析；与未用细胞因子处理的对照组比较：*P<0.05，**P<0.01

3 讨论

心肌纤维化发生的机制复杂，心脏间质中活化的心肌成纤维细胞转化为肌成纤维细胞，在多种细胞因子的作用下主要分泌Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白，导致胶原沉积与分解失衡，与心肌纤维化进展密切相关。UCH-L1在心血管疾病中的研究甚少，主要分布于神经系统、生殖系统和泌尿系统，是调控细胞生物活动的重要调节剂，然而在心血管疾病发生后，心脏细胞发生炎症反应，胶原沉积修复组织，在心脏间质细胞中可检测到UCH-L1被上调，UCH-L1可能在调节适应不良的心脏重塑和心脏肥大进而转变为心力衰竭，最后发展成心肌纤维化。该研究在Ang Ⅱ诱导的小鼠心肌纤维化模型中，给予UCH-L1的特异性抑制剂LDN57444后小鼠的心功能和心脏结构改善，说明UCH-L1确实参与心肌纤维化的进程，且LDN57444可有效改善心脏功能。在PDGF-DD诱导的小鼠心肌成纤维细胞纤维化中，通过qRT-PCR可检测到UCH-L1的mRNA相对常规培养的心肌成纤维细胞增高，差异有统计学意义，且给予UCH-L1的特异性抑制剂后，CFs中胶原蛋白分泌减少，纤维化指标减少，这表明LDN57444确实有减轻心肌纤维化的作用。

NF-κB是炎症和氧化应激的关键调节因子，直接调节各种心脏疾病状态，包括心肌梗死、缺血/再灌注损伤、肥厚和充血性心力衰竭，过去积累的证据表明NF-κB信号传导途径在心脏炎症中起重要作用。NF-κB对心肌肥厚有重要作用，而阻断NF-κB可使心肌肥厚减轻。NF-κB的阻断通过调节ECM蛋白阻止心肌肥厚，提示NF-κB在心脏纤维化中发挥重要作用。心肌纤维化过程中信号通路复杂，其中PDGFR-β/PI3K/Akt 信号通路是重要的细胞信号转导途径，心肌成纤维细胞向肌成纤维细胞转化与其密切相关。既往研究表明PI3K/Akt 信号通路在心脏心梗后促进新生血管形成有重要作用。该研究表明通过PDGF-DD诱导心肌成纤维细胞增殖分化，通过成纤维细胞膜上PDGFRβ受体，调节下游PI3K/AKT/NF-κB信号轴，给予NF-κB活化抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸铵(PDTC)后UCHL1的蛋白表达量减少。PDTC可通过抑制IκB磷酸化来抑制NF-κB的作用，降低下游细胞因子的表达。生物信息学分析显示，UCH-L1的启动子区域具有公认的NF-κB结合元件，染色质免疫共沉淀实验结果也显示UCH-L1受上游-290 bp、-118 bp处启动子序列KBS1、KBS2调控，而KBS1、KBS2是NF-κB特异性结合的序列。

视网膜母细胞瘤肿瘤抑制蛋白(Rb蛋白)是一种真正的多功能蛋白，不仅具有潜在的肿瘤抑制功能，还是控制细胞增殖的重要环节。不同的刺激信号最终通过Rb磷酸化和去磷酸化调节，进而引导其控制的E2F转录因子的活性。该研究表明UCH-L1参与Rb蛋白的翻译后调控来应对血小板源生长因子对心肌成纤维细胞的增殖反应。

该研究中PDGF-DD刺激心肌成纤维细胞后,UCH-L1的mRNA和蛋白表达增高，与对照组比较，下游胶原蛋白分泌增加，且信号轴通路上PDGFRβ、PI3K、AKT的mRNA和蛋白增加，说明PDGF-DD可促进UCH-L1的表达。UCH-L1是DUBs家族中重要一员，该研究中提示UCH-L1是心肌炎症向心肌纤维化转变的重要纽带，对于深入研究心肌炎症和心肌纤维化之间的关系有着重要的意义，药理学抑制剂(LDN 57444)具有特异抑制UCHL1的功能，能够阻断预先建立的心肌纤维化的进一步发展。泛素系统在心脏疾病中的作用和肌成纤维细胞生物学功能对心肌纤维化的研究有重大意义，UCH-L1的药物靶向治疗也为心肌纤维化的防治提供一个新的研究方向。