微小RNA-195与急性胰腺炎进展的相关性研究

安超 朱代生 张鹏飞 张丽娜 金珂

（漯河医学高等专科学校第二附属医院消化内科，河南 漯河 462300）

急性胰腺炎（Acute pancreatitis，AP）是临床上最常见的急性腹部疾病之一，通常由胆石症、酒精中毒和高脂血症引起[1]。尽管国内外学者对AP的发病机制已有一些共识，但仍然缺乏有效的诊断和治疗策略。在重症急性胰腺炎病例中，炎性细胞因子的释放可引起全身性炎性反应综合征，并与器官功能障碍有关，其中多器官功能衰竭是导致患者死亡的主要原因，在急性胰腺炎患者中发生率占10%至15%。急性胰腺炎的初始病理变化是胰腺内胰蛋白酶的失控导致胰腺腺泡细胞损伤，诱发炎症细胞和细胞因子的积累[2]。

MicroRNA（miRNA）是一类短的非编码RNA，对调节细胞增殖、凋亡、坏死和炎症起着关键作用。研究表明，循环中miRNA表达水平与胰腺腺泡细胞损伤和预后密切相关[3]。miR-195位于染色体17p13.1上，是microRNA-15/16/195/424/497家族的一员，能调节增殖、凋亡和炎症等各种病理生理过程[4]。而对于miR-195在急性胰腺炎的发生、进展中的作用研究甚少，本研究重点分析miR-195与急性胰腺炎进展相关性，为急性胰腺炎的发生、进展提供新的生物标志物。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2018年1月至2019年12月在我院接受治疗的62例AP患者，纳入标准：年龄在18至65岁之间；符合AP诊断标准。AP诊断标准：急性突然持续性上腹痛、腹胀，腹部触诊压痛阳性；经上腹部CT检查呈现AP影像学改变。排除标准：癌症患者；孕妇；精神病患者或拒绝合作的患者；放弃治疗，转院或死亡的患者。62例AP患者依据患者的严重程度分为两组，轻度患者30例（轻度组），其中男16例，女14例；年龄26-78岁，平均年龄45.26±13.22岁；中重度患者32例（中/重度组），其中男18例，女14例；年龄26-77岁，平均年龄45.26±13.22岁。选择20例同期进行体检的健康志愿者作为对照组，其中男12例，女8例，年龄25-77岁，平均年龄45.57±13.14岁；三组成员的性别、年龄等一般资料无统计学差异（P>0.05）。本研究在患者入院后均告知并签署知情同意书，并经院伦理委员会批准。

1.2 急性胰腺炎CT分级

A级：胰腺边界清晰，血淀粉酶轻度升高；B级：胰腺头、体、尾部局限性肿大或胰腺体积弥漫性肿大，血尿淀粉酶中度升高；C级：胰腺实质形态及密度异常伴有胰腺周围脂肪炎性改变，血尿淀粉酶明显升高；D级：胰腺周围多个间隙出现积液，血尿淀粉酶趋向下降；E级：胰腺周围多个间隙中2个或2个胰腺间隙积液，胰腺实质或胰周脓肿形成，血尿淀粉酶下降明显。其中A-C级为轻度胰腺炎，D、E级为重度胰腺炎[5]。

1.3 qRT-PCR检测血清中miR-195水平

患者及志愿者入院当日，采集空腹外周静脉血5 mL，室温下静置30 min，3000 rpm离心15 min，取血清，-80℃冻存。Trizol法提取总RNA，并测定RNA的纯度。RT逆转录试剂盒反转录生成cDNA后，加入BeyoFast™ SYBR Green qPCR Mix等进行PCR扩增，以U6为内参。miR-195上游序列：5´-AGCTTCCCTGGCTCTAG CA-3´；miR-195下 游 序 列：5´-CTGGAGCAGCA CAGCCAATA-3´。产物大小76 bp。内参U6上游引物：5′-GA CAGTCAGCCGCATCTTCT-3′，下游引物：5′-GC GCCC AATACGACCAAATC-3′，长度228bp。反应条件：95℃ 2min预变性，95℃ 15s变性，60℃ 30 s退火延伸，72℃延伸30 s，共40个循环。采用2-△△Ct法分析miR-195相对表达量。

1.4 MCTSI评分、BISAP评分、Ranson评分和APACHEII评分

所有患者入院后即进行改良的CT严重指数（Modified CT severity index，MCTSI）评分、急性胰腺炎严重程度床边指数（Beside index of severity in acute pancreatitis，BISAP）评分、Ranson评分，急性生理与慢性健康评分 II（Acute physiology and chronic health evaluation，APACHEII）。其中MCTSI分为3级，I级：0-2分；II级：4-6分；III级：8-10分；BISAP评分<3分为轻症急性胰腺炎，≧3分为中重症急性胰腺炎；Ranson 评分<3分为轻症急性胰腺炎，≧3分为重症急性胰腺炎；APACHEⅡ评分评分<8分为轻症急性胰腺炎，≧8分为重症急性胰腺炎。

1.5 统计学分析

采用SPSS19.0统计学软件进行分析，计量资料以均数±标准差（±SD）表示，多组间比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用SNK-q法，两组间比较采用t检验；计数资料以例数（%）表示，分析采用X2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清miR-195水平

中/重度组miR-195为8.03±2.02，轻度组为4.32±1.27，对照组为1.52±0.76，中/重度组和轻度组患者血清miR-195相对表达水平明显高于对照组，且中/重度组血清miR-195水平明显高于轻度组血清（F=32.267，P<0.05），见图1。

图1 血清miR-195表达水平

2.2 血清miR-195与患者临床特征的关系

血清miR-195与MCTSI评分、BISAP评分、Ranson评分、APACHEII存在相关性（P<0.05），而与性别、年龄无相关性（P>0.05），见表1。

2.3 miR-195诊断AP的ROC曲线下面积

miR-195诊断AP的ROC曲线下面积为0.881，诊断AP的准确性较好。截断值为4.08，灵敏度为91.7%，特异度为86.2%，见图2。

3 讨论

AP是一种常见的临床疾病，近年来其发病率一直在上升。它是由胰腺酶活化失调引起的急性炎症反应引起的，还可引发其他一系列并发症的产生，并出现多器官功能障碍[6]。AP患者可能伴有恶心、呕吐和疼痛等各种临床症状，易误诊为 消化不良。目前，AP的发病机制仍不明确。

表1 血清 miR-195与患者临床特征的关系

图2 miR-195诊断AP的ROC曲线下面积

MicroRNA（miRNA）是内源性非编码RNA，通过与靶mRNA的互补位点结合以进行切割（完美匹配）或翻译抑制（不完美的目标双链体）而在机体中发挥重要作用，主要参与生理和病理条件下多种细胞类型的调节，例如发育、增殖、凋亡、新陈代谢以及疾病[7]。近年来研究主要集中在胰腺癌中miRNA的表达，而关于miRNA在AP发生中的作用研究很少。miR-195属于一种多功能miRNA，研究显示miR-195在糖尿病患者玻璃体、视网膜组织中被上调并参与氧化应激诱导的视网膜内皮细胞损伤[8]。

本文采用qRT-PCR技术分析AP患者及志愿者血清miR-195水平。显示，AP患者血清miR-195水平明显高于对照组，而中/重度组明显高于轻度组，说明miR-195参与了AP的发生和进展。而且miR-195与MCTSI评分、BISAP评分、Ranson评分、APACHEII密切相关，进一步证明miR-195水平与患者的疾病的严重程度存在一定的相关性，并可能成为判断AP严重程度的预测性生物标记物。而且通过计算miR-195诊断AP的ROC曲线下面积发现其AUC值介于0.7-0.9之间，诊断准确性较好，并具有较高的灵敏度和特异度。

综上所述，miR-195参与了AP的发生和发展，其水平能反应AP患者的严重程度，可以作为诊断AP严重程度的标记物，值得临床推广。