GeneXpertMTB/RIF Assay对肺部结核的临床诊断及治疗价值

胡新

（甘孜藏族自治州州人民医院检验科，四川 甘孜 626000）

结核病是由结核分枝杆菌（Mycobacterium Tuberculosis，MTB）引起的全身多器官系统感染性疾病，以肺结核最为常见[1]。由于结核的治疗一般需要多种药物联合使用，长期规律治疗，并且在治疗中可能会存在耐药，因此选择合适的方法快速、准确的诊断结核及耐药情况是患者治疗开展的基础[2]。GeneXpert MTB/RIF Asaay检测系统系统是由美国Cepheid公司研发，将样品准备、定量PCR扩增和荧光检测集于一身并自动进行MTB核酸分析的系统。该系统采用半巢式实时荧光定量PCR，针对rpoB基因81 bp利福平（Rifampicin，RIF）耐药区间设计引物、探针，检测其是否有突变，能够在2 h内检测出患者是否感染结核或对利福平耐药，很大程度满足临床需求[3]。基于此，本研究选取2019年1月至2019年12月在甘孜藏族自治州人民医院住院的临床症状和影像学检查诊断为肺结核患者的痰液标本148份，同时选取50份肺部感染（非结核感染）的痰液标本，采用GeneXpertMTB/RIF Assay以及传统的涂片抗酸杆菌检查、BACTEC MGIT960检测法对结核杆菌进行测定，旨在探讨GeneXpertMTB/RIF Assay检测法的优点，现将研究报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2019年1月至2019年12月在甘孜藏族自治州人民医院住院的临床症状和影像学检查诊断为肺结核患者的痰液标本148份，同时选取50份肺部感染（非结核感染）的痰液标本；分别采用涂片抗酸杆菌检查、BACTEC MGIT960检测法和GeneXpertMTB/RIF检测法检测痰液标本中的结核分枝杆菌表达情况，并分别采用MGIT960药敏法和GeneXpertMTB/RIF检测法测定MTB对RIF耐药的情况。

1.2 纳入标准

所有患者均符合肺结核的相关诊断标准[4]，并经影像学及细菌学检查确诊；未合并其他肺部疾病。

1.3 仪器与试剂

抗酸染液为珠海贝索生物技术有限公司提供；罗氏固体培养基与分枝杆菌培养添加剂、培养管以及分枝杆菌用联合药敏试剂盒和痰消化液均由碧迪医疗器械有限公司提供；BACTECMIT960、全自动GeneXpert仪器及GeneXpert Mtb/RIF检测试剂盒GeneXpert MTB/RIF Asaay检测系统均购自美国Cepheid公司。仪器包括四通道半巢式荧光定量PCR分析仪，计算机及操作系统软件、KDC-2046低速冷冻离心机。

1.4 方法

1.4.1 MGIT960检测MTB及MGIT960药敏法

痰液标本加入等量体积4%氢氧化钠溶液，置震荡器振荡液化15 s后，孵育不超过20 min，加入PBS后振荡离心（3950 r·min-1，15 min，离心半径8 cm）后弃上清液，加入PBS 2 ml混匀，取0.5 ml标本处理液上机测试，若结果为阳性，则挑选阳性菌落涂片、转种于罗氏培养基；取出阳性第3天～第5天培养管，取1 ml标本液和4 ml无菌生理盐水作为稀释菌液，再以此稀释菌液1∶100稀释作为对照菌液，分别加入500 μl对照菌液和稀释菌液于BACTEC MGIT960对照管及加有RFP的药物培养管中颠倒混匀。放入BACTEC MGIT960培养箱中，15 d内仪器自动报告敏感与耐药结果。

1.4.3 GeneXpertMTB/RIF Assay检测法

（1）前处理：取1 ml痰标本于样品管中，加入2倍体积的SR，震荡20 s后静置15min。取2 ml处理后样本液，加入Cartrige反应盒内。

（2）检测：将含标本液的Cartrige盒放入模块中，系统自动进行核酸提取、扩增，以及目标序列的检测和结果判断。反应结束后判读痰液标本中是否存有MTB以及是否对RIF耐药。

（3）GeneXpertMTB/RIF检测法对MTB的结果分为：MTB检出（极低，低，中，高）和未检出。GeneXpertMTB/RIF检测法对RIF耐药的检测结果分为：RIF Resistance检出，即RIF耐药；RIF resistance未检出，即RIF敏感。本次对GeneXpertMTB/RIF检出都判定为MTB检出阳性。

1.4.4 涂片抗酸杆菌检查

涂片经火焰固定，加石碳酸复红液染色5~10 min后，加酸性酒精溶液脱色1~2 min，重复操作直至红色完全脱掉，加亚甲基蓝溶液染色30 s，水洗、干燥、镜检。

1.5 观察指标

以细菌学结果为金标准，比较不同检测方法对结核分枝杆菌检出的情况；敏感度=真阳性例数/（真阳性例数+假阴性例数）×100%；特异度=真阴性例数/（真阴性例数+假阳性例数）×100%。

以MGIT960药敏法为标准分析GeneXpertMTB/RIF Assay检测法检测RIF耐药性的敏感性及特异性。

1.6 统计方法

本研究数据均采用SPSS18.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（X ±SD）表示，采用t检验；计数资料以率或构成比表示，采用X2检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 不同检测方法对MTB检出情况比较

GeneXpertMTB/RIF、MGIT960培养法及直接涂片法检测痰液标本中MTB的敏感度分别为60.14%、58.11%、24.32%，GeneXpertMTB/RIF与MGIT960培养法比较无差异（P>0.05），与直接涂片法比较有明显差异（P<0.05）；特异度分别为100.00%、92.00%、94.00%，GeneXpertMTB/ RIF与MGIT960培养法和直接涂片法比较均有显著差异（P<0.05），见表1。

2.2 GeneXpertMTB/RIF检测法对RIF耐药性测定的敏感性及特异性

148例肺结核标本中，BACTECMIT960法检测86例阳性，其中有79例GeneXpertMTB/ RIF也为阳性；以MGIT960药敏法为标准，79例标本的GeneXpertMTB/RIF检测法检测RIF耐药性 的敏感度为100.00%，特异度为95.31%，见表2。

表1 不同检测方法对MTB的检出情况

表2 GeneXpertMTB/RIF检测法检测RIF耐药性的敏感性及特异性

3 讨论

利福平是治疗结核病的常用药物。但是，研究发现利福平在耐多药结核中非常常见，发生频率超过95%，因此对于肺结核来说，快速明确诊断、确定结核菌耐药情况对结核病临床治疗意义重大[5]。

传统痰涂片抗酸染色，虽然费用低，但假阴性很高，容易漏诊病人，并且对病人合理用药无法提供参考。而液体培养法MGIT960检测MTB及药物敏感性准确度高，但耗时长，最快阴性报告需要一周的时间，而阳性及药敏报告在无污染和其他因素的干扰下也需要最少两周左右的时间[6]，不利于早期诊断。随着分子生物学的发展，GeneXpert MTB/RIF系统被用于结核病和MTB RIF耐药性的快速检测和诊断。该系统为全自动一体化半定量巢式实时聚合酶链反应系统，主要针对MTB的81 bp利福平耐药核心区间设定引物、探针并进行扩增检测，根据其是否发生基因突变来检测样本中是否含有MTB及其是否对利福平耐药，核酸提取、纯化及浓缩均为全自动化处理，因此可在2 h内获得结果[7]。本研究通过多种方法检测痰液标本结果发现，GeneXpertMTB/RIF对MTB检出的敏感性和特异性均较传统检测方法高；GeneXpertMTB/RIF检测示MTB对利福平耐药的敏感度为100.00%，特异度为95.31%。

可见，GeneXpertMTB/RIF 检测法的检测速度快、灵敏度高、特异性强，有助于实验室结核分枝杆菌及其耐药性的快速鉴定和筛查，对结核病患者的早期诊断和治疗有着非常重要的价值。