基于叶片结构分析的不同品种核桃抗旱性评价

云琳颖，刘 凯，李林晴，赵书岗，王红霞

(1.河北农业大学 生命科学学院，河北 保定 071001； 2.河北农业大学 园艺学院,河北 保定 071001；3.河北省山区研究所/国家北方山区农业工程技术研究中心，河北 保定 071001)

核桃是世界著名的“四大干果”之一，栽培历史悠久，也是我国的重要经济树种[1]。近几年来，核桃种植面积逐年扩大，品种化发展迅猛，一些良种得到迅速推广，但品种适应性存在差异，造成部分良种出现问题，抗逆性差是部分品种极为突出的问题。干旱是我国常见的自然灾害，北方山区是核桃主产区，近些年干旱频发[2-3]，其影响区域广、延续时间长，危害严重。干旱不仅是水分的缺少，还往往伴随着高温干燥等现象[4]，也可造成植株的灼烧现象。水是构成植物体的重要因子，叶片通过蒸腾作用为植株供水，但在干旱条件下，水分运输缓慢甚至停止，妨碍光合作用，影响植物生存、成长、繁殖等[5]。植物受环境中的胁迫主要体现在叶片结构的变化[6]，特别是植物应对干旱时，产生的生理反应使其叶片中各组织形态发生变化，因此研究叶片结构对于评价植物抗旱性具有十分重要的意义[7-8]。干旱条件下，植物叶片结构发生显著变化，如表皮细胞细胞壁和角质层显著增厚[9]，栅栏组织高度发达[10]，海绵组织相对减少[11]，栅栏组织与海绵组织比值升高等[12]。朱广龙等[13]研究发现，酸枣在干旱加剧条件下，叶片厚度增厚，角质层加厚。叶脉中维管束及薄壁细胞的分布与植物体内运输效率直接相关[14]，长柄扁桃中抗性最强的品种其维管组织发达，贮水细胞丰富[8]，酸枣在梯度干旱条件下叶脉导管管径增大，薄壁细胞相对厚度逐渐减小[13]。气孔的分布能够反映植物对CO2的吸收效率，有研究发现，干旱条件下，气孔密度越大，越有利于短时间充分利用有效水分进行光合作用，并利用散热减少植株损伤[15]。但也有学者认为，气孔密度小，则抗旱力增强[16]。此外，气孔的长度也可体现抗性的强弱，裸子植物中下表皮气孔越小，抗旱性越强。因此，抗旱性强的植株具有叶片厚度大、栅栏组织厚度大、海绵组织厚度小、气孔密度高、表皮致密等特点[17]。

核桃是北方山区的重要经济林树种，北方山区旱情频发严重影响了核桃生产，因此对抗旱品种及砧木的选育及推广提出迫切需求。此前，白重炎等[18]对核桃(J.regia)种内部分品种开展过抗旱性评价，然而前人很少关注核桃属内不同品种的抗旱性差异，鉴于此，通过对叶片组织结构、叶脉及气孔特征分析，结合主成分分析法筛选合适的抗旱指标，对核桃不同品种进行抗旱性评价，旨在为抗旱品种及砧木选育提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 试验地点

试验地位于河北省保定市河北农业大学教学标本园，地处冀中平原西部，北纬38°10′～40°00′，东经113°40′～116°20′，年平均气温12 ℃，年降水量550 mm，属于温带季风性气候。

1.2 供试材料

选取树龄及生长势一致的不同品种的核桃：黑核桃(Juglansnigra)、杂交黑核桃(J.major×J.regia),普通核桃品种辽宁1号(J.regia‘Liaoning1’)、晚实品种清香(J.regia‘Qingxiang’)、实生优株2(J.regia)，分别用代号JN、MR、JL1、QX、YZ2表示。于2018年5月下旬选择各类型东南方向中部无病虫害核桃叶片，选取复叶的第3枚小叶(自上而下、从左至右的顺序)备用。

1.3 试验方法

在叶片近基部1/3处，以主叶脉为中心切取0.5 cm2样品，FAA固定后，经脱水，二甲苯过渡，石蜡包埋，YD-3旋转式切片机切片(厚度6 μm)，番红-固绿染色，制成永久切片。BH-2显微镜(Olympus)观察，每品种选取10个叶片，每叶片选取15个视野，利用软件Motic images plus 2.0测量叶片结构指标。选取同一叶片中部区域，在叶背涂胶水，利用印迹法统计气孔相关指标[19]。

1.4 数据处理

利用模糊隶属函数法进行数据分析，对不同类型核桃抗旱性进行评价[20]。采用Excel 2017和SPSS 20.0软件进行方差分析和主成分分析。

2 结果与分析

2.1 核桃叶片的横切结构

2.1.1 叶片组织结构特征 由表1和图1可知，各品种核桃叶片厚度存在显著差异，普通核桃类型(JL1、QX、YZ2)叶片较厚，其中，辽宁1号叶片厚度为186.0 μm，而黑核桃和杂交黑核桃叶片厚度分别为122.6 μm和119.1 μm，均显著小于3种普通核桃；各品种上表皮厚度为12.1～13.7 μm，差异不显著，下表皮厚度介于12.1～16.2 μm，其中黑核桃下表皮厚度为16.2 μm，显著大于其他各品种；黑核桃上下表皮细胞在叶片横切中相对体积较大(图1A)，杂交黑核桃与其类似(图1C)。栅栏组织多层普遍被认为是植物抗旱的表现之一，各品种核桃叶片栅栏组织均呈现多层，普通核桃类型(JL1、QX、YZ2)叶片栅栏组织多为2层，局部为3层，并且其栅栏组织排列较黑核桃和杂交黑核桃更紧密。各品种核桃的叶片栅栏组织厚度在49.8～83.0 μm，其中，辽宁1号栅栏组织厚度达83.0 μm，而黑核桃仅为49.8 μm；上层栅栏组织较下层栅栏组织厚，其中，辽宁1号上层栅栏组织厚度为49.9 μm，显著高于其他核桃。与栅栏组织类似，黑核桃和杂交黑核桃的海绵组织厚度均小于普通核桃类型(JL1、QX、YZ2)，其中，杂交黑核桃海绵组织厚度为40.2 μm，而3种普通核桃类型海绵组织厚度均大于65 μm，并且3种之间差异不显著。5个类型核桃栅栏组织与海绵组织厚度比值均大于1。

表1 不同品种核桃叶片结构差异Tab.1 Analysis of leaves structures in different walnut varieties

A—E分别为JN、JL1、MR、QX和YZ2;Sp:上表皮，Xp：下表皮，Zl：栅栏组织，Hm：海绵组织。标尺=50 μmA—E: JN,JL1,MR,QX and YZ2; Sp: Upper epidermis,Xp: Lower epidermis,Zl: Palisade tissue,Hm: Spongy tissue.Bar is 50 μm图1 不同品种核桃叶片横切结构Fig.1 Leaves structure of different walnut varieties

2.1.2 主叶脉及气孔特征 叶脉和维管束是水分运输的主要通道，发达的主叶脉和维管束是植物对干旱环境的适应[13]，二者是评价植物抗旱性的重要指标。由表2可知，各品种核桃的主叶脉厚度差异较大，其中3种普通核桃主叶脉厚度显著大于2种黑核桃类型，其中清香为1 478.0 μm，杂交黑核桃仅为834.0 μm；维管束厚度与主叶脉厚度表现一致，杂交黑核桃仅为441.3 μm，清香为957.7 μm；各品种维管束与叶脉厚度比均大于0.50，说明维管束占据整个主叶脉的1/2以上，其中清香显著大于其他核桃；各品种核桃叶片主叶脉维管束均由上、下两部分组成(图2)，清香的主叶脉维管束木质部和韧皮部均较大，而黑核桃和杂交黑核桃较小；主叶脉中上、下薄壁组织也存在较大差异，3种普通核桃上薄壁组织较厚，其中实生优株2为327.3 μm，显著大于其他核桃，而黑核桃和杂交黑核桃上、下薄壁组织均较薄，特别是向光层即上薄壁组织，杂交黑核桃仅为194.0 μm，显著小于其他类型。

表2 不同品种核桃主叶脉及气孔特征 Tab.2 Analysis of vein structures and otomatal feature in different walnut varieties

A—E分别为JN、JL1、MR、QX和YZ2;M：木质部；Sr:上韧皮部；Xr:下韧皮部；Sb:上薄壁组织；Xb:下薄壁组织；标尺=200 μmA—E: JN,JL1,MR,QX and YZ2;M:Xylem;Sr:Upper phloem;Xr:Lower phloem;Sb:Upper parenchyma;Xb:Lower parenchyma;Bar is 200 μm图2 不同品种核桃叶脉横切结构Fig.2 Vein structure of different walnut varieties

气孔是植物进行蒸腾作用，与外界气体交换和吸收水分的重要通道。各品种中清香气孔密度显著大于其他类型，为428.1个/mm2，实生优株2气孔密度显著小于其他类型，为262.6个/mm2，黑核桃、辽宁1号和清香核桃的气孔较长，而杂交黑核桃气孔长度和宽度最小，仅为12.0 μm和5.2 μm(表2)。

2.2 不同品种核桃抗旱指标的主成分分析

由表1和表2可知，各品种核桃在叶片厚度、栅栏组织厚度、海绵组织厚度、栅栏组织与海绵组织厚度比、下表皮厚度、上层栅栏组织厚度、下层栅栏组织厚度、主叶脉厚度、维管束厚度、木质部厚度、维管束与主叶脉厚度比、上韧皮部厚度、下韧皮部厚度、上薄壁组织厚度、下薄壁组织厚度、气孔长度、气孔宽度以及气孔密度等18项指标均存在显著差异，变异系数在9.07%～48.10%，具有一定的代表性和较高灵敏度，作为评价指标均具有显著意义[21]。因过多相关指标不利于揭示类型特征，易产生认识偏差，故选取变异系数大于20%的指标，对其进行主成分分析，根据累积贡献率≥85%的原则抽取主成分，根据各主成分中每个指标载荷量及变异系数大小选取代表性指标。

经主成分提取后前4个主成分的累积贡献率已达88.60%(表3)，很好地保留了选取指标的大部分信息。根据载荷值越大，其对主成分贡献越大，典型性越强的原则，对4个主成分进行分析，在第一主成分中，叶片厚度、主叶脉厚度、维管束厚度、下韧皮部厚度具有较大的载荷值，主要反映了叶片输导能力。第二主成分中，气孔长度、气孔宽度、气孔密度均有较大的载荷值，主要反映了气孔特征。同样，第三主成分中，气孔特征出现较大的载荷值。第四主成分中，下薄壁组织厚度具有较大载荷值，反映了叶脉贮水能力。

表3 主成分载荷矩阵 Tab.3 Principal components matrix

根据主成分分析结果进行指标筛选，鉴于第一主成分贡献率达到58.64%，并且叶片厚度、维管束厚度和下韧皮部厚度有较大变异系数，能够代表植株的输导能力，因此,选取为第一主成分典型指标。第二主成分中气孔长度和第三主成分中气孔宽度，具有较大变异系数，选取气孔长度和宽度为第二和第三主成分典型指标。第四主成分中下部薄壁组织厚度载荷值远大于其他指标，故选取其为第四主成分典型指标。

经方差分析和主成分分析，从原来18个指标中选出叶片厚度、维管束厚度、下韧皮部厚度、气孔长度、气孔宽度和下薄壁组织厚度作为不同类型核桃抗旱性预测的主要指标。

2.3 不同品种核桃抗旱性比较

对各品种所筛选的指标进行分析，发现不同类型核桃叶片维管束厚度、下韧皮部厚度、气孔长度、叶片厚度、下薄壁组织厚度均具有较大差异，故采用模糊数学隶属函数法进行比较，对5种核桃的5个指标的隶属函数值进行累加，取其平均值，平均值越大，则抗旱性越强。如表4所示，经综合评价后抗旱能力：黑核桃>清香>辽宁1号>杂交黑核桃>实生优株2。

表4 不同核桃品种抗旱性比较 Tab.4 Comparison of drought resistance of different walnut varieties

3 结论与讨论

叶片是植物光合作用的中心，是在环境中暴露面积最大的器官，植物体受干旱胁迫时，叶片结构最快发生响应，而这种响应直接反映植物体的抗旱能力[13]。不同学者对植物叶片抗旱性指标筛选存在差异，江川等[21]通过对5种灌木叶片抗旱性进行研究，从10个抗旱指标中筛选出叶片厚度、上表皮厚度和气孔长度3项指标；刘红茹等[22]对10种阔叶园林植物进行研究，从15个指标中筛选出下表皮厚度、栅栏组织厚度、维管束厚度、气孔密度4项指标作为评价指标,白重炎等[18]通过对12种普通核桃品种叶片结构分析，从7个指标中筛选出上表皮厚度、栅栏组织与叶片厚度比值及叶脉维管束长径为较好的抗旱指标。本研究筛选出维管束厚度、下韧皮部厚度、气孔长度、叶片厚度、下薄壁组织厚度共5项指标，结合前人研究发现，气孔结构均出现在各个研究所筛选出的指标中，说明气孔特征是抗旱性研究的最重要指标之一。此外，前人研究中所筛选出的指标均出现维管组织特征或表皮细胞特征[18，21-22]，而本研究的所筛选的维管束厚度、下韧皮部厚度均反映了维管系统的特征，说明输导能力强弱是植物抗旱的关键因素。前人研究发现，紫叶小檗及连翘抗旱性相对较差，其栅栏组织和海绵组织厚度均小于1，且叶脉中维管束所占比例相对较小[21-22]。本研究发现，各类型核桃叶片结构中，栅栏组织表现为多层，维管束与主叶脉厚度比值大于0.50，栅栏组织与海绵组织厚度比值大于1，说明核桃整体抗旱性较强。

选育抗旱品种及砧木是我国核桃育种的重要方向之一，目前国内外核桃砧木多以普通核桃、奇异核桃、北加州黑核桃、黑核桃或者种间杂交种为主[23]。国外研究认为奇异核桃和小果胡桃对干旱适应能力较强，可用作普通核桃的砧木，而国内核桃以普通核桃和核桃楸为主，也具有较强的抗旱性[24]。清香作为晚实核桃优良品种，其抗旱性相对较强，这与其在立地条件差、土层瘠薄山区表现良好具有一致性[26]。一般认为黑核桃的抗旱性优于普通核桃[25]，本研究结果与其一致，鉴于黑核桃较普通核桃品种更具抗旱性，可作为砧木育种的良好种质。