根际细菌吡咯伯克霍尔德氏菌YZU-S377对棉花黄萎病的防效及其促生作用研究

刘 璐，万伟杰，郑通文，龙欣钰，孙正祥，周 燚

(长江大学 农学院/湖北省农林病虫害预警与调控工程技术研究中心，湖北 荆州 434025)

棉花(MalvaceaegossypiumL.)是一种重要的经济作物，世界上约有60%的棉花产自亚洲大陆[1-2]。由大丽轮枝菌(Verticilliumdahliae)引起的棉花黄萎病是导致我国棉花受危害最严重的病害[3]，该病害分布广、危害重，是一种土传的维管束病害[4]，最早于1914年在美国被报道，1935年传入我国，并不断蔓延扩散[5]。棉花黄萎菌的防治目前主要有选育抗病品种和化学防治，抗病品种的防效虽好，但选育周期长；化学防治效果有限，耗费大，且影响环境和人类健康[6]。而生物防治因具有成本低、污染小、可持续发展等优点，逐渐被人们重视。

目前，用于植物病害防治的生物因子包括微生物、抗生素和植物诱导剂等，其中，微生物应用最广泛。用于防治棉花黄萎病的生防菌株较多的是芽孢杆菌(Bacillussp.)[7]，如多黏类芽孢杆菌[8]、甲基营养型芽孢杆菌[9]、枯草芽孢杆菌[10]，而关于吡咯伯克霍尔德氏菌防治棉花黄萎病害的报道较少。菌株YZU-377(S377)是本实验室(长江大学农学院植物与微生物互作实验室)前期获得的1株植物根际细菌，具有广谱抑菌作用，经鉴定为吡咯伯克霍尔德氏菌(Burkholderiapyrrocinia)[11]。为进一步拓展棉花黄萎病的生防菌资源，测定了菌株S377对棉花黄萎病的防效、对棉花的促生作用及其在棉花植株内的定殖动态，以期为棉花黄萎病生防菌的基础研究和开发应用提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株及棉花品种 菌株S377：由本实验室从水稻根际分离筛选并保存。

标记菌株YZU-S377GFP(S377GFP)：将pBBR1MCS2-Tac-EGFP质粒导入YZU-S377，由本实验室前期转化完成。

棉花黄萎病菌Vd080(Vd)和冀棉11：均由中国农业科学院棉花研究所惠赠。

1.1.2 培养基 NA培养基(营养肉汤固体培养基)、PDA培养基(马铃薯葡萄糖培养基)、NB培养液(营养肉汤液体培养基)、察氏培养基，配方见参考文献[12]。

1.2 菌株S377对棉花黄萎病菌的抑制作用测定

1.2.1 菌株S377发酵液对棉花黄萎病菌菌丝生长的抑制作用 在NA上活化S377，挑取单菌落接种到NB中，28 ℃、130 r/min振荡培养24 h作为种子液。以1%的接种量接种至200 mL NB中，28 ℃、130 r/min振荡培养48 h，获得发酵液，备用。

选取棉花黄萎病菌Vd菌饼(5 mm)置于PDA平板中央，在距离菌饼25 mm处呈3点对称打孔(直径5 mm)，每孔分别注入100 μL S377发酵液，以每孔加入100 μL NB为对照(CK)。25 ℃恒温培养15 d后，测定抑菌带的大小，并计算抑菌率[13]。试验重复3次。

1.2.2 菌株S377无菌滤液对棉花黄萎病菌菌丝生长的抑制作用 参照1.2.1的方法，将菌株S377培养7 d后离心收集上清液，通过滤膜(0.22 μm)过滤，获得无菌滤液。待PDA培养基冷却至55 ℃左右，将S377无菌滤液分别按10%、20%、30%、40%比例混合倒板，在平板中央接种Vd菌饼(直径5 mm)，每个处理设置3个重复。以加入同体积NB作为对照(CK)，25 ℃恒温培养，待对照Vd长满培养皿的2/3时，采用十字交叉法测量菌落直径并计算抑菌率[13]。试验重复3次。

1.3 菌株S377对棉花黄萎病的盆栽防效测定

播种：棉花种子经4% NaClO处理5 min，无菌水漂洗3次后温汤浸种3 h，播种于盆钵(11 cm×11 cm×10 cm)中，每个盆钵中盛有800 g灭菌土壤。出苗后，每盆保留4株健康植株。Vd孢子悬浮液制备：将Vd接种于PDA平板上，25 ℃培养7 d，然后接种到察氏培养基中，25 ℃、130 r/min振荡培养7 d，3层纱布过滤，获得孢子悬浮液。菌株S377发酵液的制备：将活化的S377菌液按1∶100(V/V)接入NB，130 r/min、28 ℃振荡培养24 h。

试验设置4个处理：1)S377；2)NB+Vd(对照)；3)S377+Vd；4)NB。播种21 d后，灌根接入S377菌液(1×109cfu/mL)，每株棉苗灌10 mL，同时灌根接种Vd孢子悬浮液(1×107个/mL)[14]，每株棉苗灌10 mL。每处理10盆，3次重复。将盆钵置于光照温室中，光照∶黑暗=16 h∶8 h，(25±2)℃培养。接种30 d后，观察病害发生情况和计算病情指数等指标[15]。

1.4 菌株S377对棉花种子萌发及幼苗的促生作用测定

1.4.1 菌株S377无菌发酵液对棉花种子萌发的促生作用 参照1.2.2的方法制备S377无菌发酵液，消毒后的棉花种子浸泡于S377无菌发酵液[16]，28 ℃、130 r/min振荡培养24 h后置于铺有2层湿润滤纸的培养皿中，每皿15粒种子，以NB培养液为对照，每处理3次重复。置于25 ℃、光照∶黑暗=16 h∶8 h的培养箱中。分别于7、14 d后计算种子的发芽率和生长参数[17]。

1.4.2 菌株S377发酵液对棉花幼苗生长的促生作用 参照1.3的方法播种棉花种子，然后灌根接入S377菌液(1.0×107cfu/mL)，每粒种子10 mL，以倒入等量的NB为对照。将盆钵置于光照温室中，光照∶黑暗=16 h∶8 h，(25 ± 2)℃培养。每个处理20株棉苗，3次重复。在播种15 d后，测定幼苗长度、根长、鲜质量和光合作用SPAD值[15]。

1.5 菌株S377生物被膜形成强度的测定

采用结晶紫染色法[18]，分别测定菌株S377在OD600为0.10、0.15、0.20、0.25、0.30时的生物被膜形成强度，重复3次。

1.6 菌株S377在棉花根部的定殖动态测定

常规温室育苗，待棉苗长至2片真叶期时，灌根接种S377GFP培养液(1×109cfu/mL)，每株10 mL。接种1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21 d后分别取棉花根尖组织，制片置于荧光显微镜下观察菌株定殖情况。另取上述不同时间的棉花根部组织，清洗干净，称鲜质量1.0 g，剪碎后充分研磨，梯度稀释。取100 μL稀释液涂布于50 μg/mL的卡那霉素NA平板上，计数菌落，3次重复[19]。

1.7 数据处理

采用SPSS 20.0和GraphPad Prism 7处理和分析试验数据。

2 结果与分析

2.1 菌株S377对棉花黄萎病菌的抑制作用

平板对峙结果表明，菌株S377能显著抑制棉花黄萎病菌(Vd)菌丝的生长，相对抑制率为89.22%(图1)。

a：对照; b：S377发酵液a: Control; b: S377 fermentation broth图1 菌株S377对棉花黄萎病菌(Vd)菌丝生长的抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of strain S377 on mycelial growth of Verticillium dahliae (Vd)

S377无菌滤液对棉花黄萎病菌的抑制作用测度结果表明，10%、20%、30%和40% 4种比例的S377无菌发酵液对Vd均具有抑制作用，其中，40%时抑制作用最显著，为61.06%(表1)。

表1 菌株S377无菌滤液对Vd菌丝生长的抑制作用Tab.1 Inhibitory effect of sterile filtrate of strain S377 on the growth of Vd mycelia %

2.2 菌株S377对棉花黄萎病的盆栽防效

盆栽防效测定结果(图2)表明，菌株S377对棉花黄萎病具有良好的防效，对照组(NB+Vd)的病株率和病情指数分别为33.33%、25.04，而处理组S377+Vd的病株率和病情指数分别为25.04%、9.38，其相对防效为62.53%。

2.3 菌株S377对棉花种子及幼苗的促生作用

2.3.1 菌株S377无菌发酵液对棉花种子萌发的影响 S377无菌发酵液处理棉花种子后，种子的发芽率和幼根总鲜质量显著高于对照。棉花种子发芽率提高了22.22个百分点；7 d时鲜质量相对对照组增加了0.06 g，14 d时增加了0.08 g；7 d时根长与对照组无显著差异，但14 d时显著高于对照组，棉花种子根长增加了17.34 mm，差异显著(表2)。

图2 菌株S377对棉花黄萎病的盆栽防效Fig.2 Control effect of strain S377 on Verticillium wilt of cotton

表2 菌株S377 无菌发酵液对棉花种子萌发的影响Tab.2 Effects of sterile fermentation broth of strain S377 on cotton seed germination

2.3.2 菌株S377发酵液对棉花幼苗的促生作用 S377发酵液处理棉花幼苗后，处理组苗长、根长和鲜质量均显著高于对照，苗长增加了4.00 mm，根长增加了27.78 mm，苗鲜质量增加了0.73 g，根鲜质量增加了0.05 g。SPAD值与对照组无显著差异(表3)。

2.4 菌株S377的生物被膜形成强度

生物被膜测定结果(表4)表明，菌株S377在OD600等于0.15、0.25 时的生物被膜形成强度较显著，分别为1.336、1.148。

表4 菌株S377 生物被膜形成强度Tab.4 Biofilm formation intensity of strain S377

2.5 菌株S377在棉花植株的定殖动态能力

定殖动态检测结果(图3)表明，S377GFP灌根处理棉花植株后，1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21 d均能在棉花根尖组织观察到绿色荧光信号，持续达到21 d。

a：1 d；b：3 d；c：5 d；d：7 d；e：9 d；f：11 d；g：13 d；h：15 d；i：17 d；j：19 d；k：21 d图3 S377 在棉花根部的荧光观察Fig.3 Fluorescence observation of S377 in cotton roots

经回收检测发现，菌株S377GFP接种到棉花根部以后，菌株的数量呈先增后减趋势，即在第1～7天是持续增长的过程，在第7 天达到最高水平后逐渐降低(图4)。

3 结论与讨论

棉花黄萎病是棉花生产中最严重的病害之一[20]。选育抗病品种是从根本上控制棉花黄萎病的有效防治策略，但是目前常规选育出的棉花品种对棉花黄萎病的控制效果尚不理想，且尚无杀真菌剂可高效防治棉花黄萎病[21]。筛选棉花黄萎病的生防菌及其开发应用，是目前该病害生物防治研究的主要内容。迄今为止，关于吡咯伯克霍尔德氏菌防治棉花黄萎病害的报道较少，闵莉静等[22]、杨欣等[23]研究的吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007对3种杨树溃疡病病原真菌具有较强的拮抗作用，同时JK-SH007能在杨树体内高效定殖，具有显著的促生作用。

菌株S377对棉花黄萎病的盆栽防效为62.53%，表明该菌株在棉花黄萎病防治方面具有较好的应用前景。此外，还发现菌株S377处理对棉花植株在苗长、根长和鲜质量方面具有明显的促生作用，可以增强棉花植株的抗病能力，提高其抵抗棉花黄萎病害侵染的能力。目前，生防菌的定殖能力及动态规律研究已是生防微生物应用和研发的前提条件[24]。有研究表明，根际细菌的定殖能力与生物被膜的形成有关[25]。生物被膜的产生促进了枯草芽孢杆菌对由丁香假单胞菌感染引起的拟南芥根部病害的生物防治[26]。菌株S377具有形成生物被膜的能力，S377GFP可以在棉花根部定殖并进行大量繁殖，说明菌株具有定殖的能力。测定拮抗微生物在根系的定殖量是通过促生或生物防治提高作物生产力相关研究的重要手段[27]。

本研究表明，S377GFP可能成为有害化学物质的生态友好型和可持续型替代品，用于促进作物生长和控制作物病害的。具有生物防治潜力的内生细菌，其种群大小是控制植物病原体的重要因素之一[28]。这一事实可能是S377具有防治棉花黄萎病潜力的有力证据。但在病株棉花体内S377的定殖情况以及将S377GFP导入棉花体内有效且便捷的接种方式有待进一步探究。本研究采用的盆栽试验方法是传统的灌根法，一般认为Vd的侵入点位于寄主植物的根尖部分，针刺法等是更有效且发病快速、均匀的方法[29]，今后可采取这些方法对S377GFP进行盆栽防效试验。本研究测定了S377GFP在棉花根部的定殖动态，但未探究在Vd存在的情况下，其在棉花体内的定殖动态。由于Vd一般从棉花根尖侵入，进而侵染到维管束，再沿维管束向上侵染到茎叶，最后侵染全株植物，所以可进一步探索S377GFP在棉花体内的传导过程。此外，菌株S377的拮抗物质尚不明确，可进一步探究，为棉花黄萎病的生物防治提供优良的菌种资源。