貂源肺炎克雷伯菌的分离鉴定及胞外分泌蛋白的核酸酶活性分析

贾艳艳，李 琦，王晓利，牛俊辉，毛 静，廖成水，张昊恺，张明亮,3

(1.河南科技大学 动物科技学院/洛阳市活载体生物材料与动物疫病防控重点实验室，河南 洛阳 471023；2.河南科技大学 医学院，河南 洛阳 471023； 3．安阳工学院 生物与食品工程学院，河南 安阳 455000)

随着毛皮动物养殖业的快速发展，因管理不当、生物安全措施弱等原因致使毛皮动物疫病发生率提高，死亡率可达10%～20%，给毛皮动物养殖业带来了较大的经济损失，影响了我国毛皮动物养殖业的可持续发展。毛皮动物疾病中因肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)引起的疾病越来越多[1]，2012—2013年，山东省毛皮动物(狐、水貂、貉)肺炎克雷伯菌感染率高达37.58%[2]。

肺炎克雷伯菌是一类革兰氏阴性杆菌，也是人兽共患条件致病菌[3-4]。该菌常存在于人类、动物的呼吸道和肠道中，也广泛存在于自然界土壤和水中，引发人和动物子宫内膜炎、肺炎、化脓性脑膜炎及泌尿道炎症等疾病。现已从水貂、鱼类、禽类、猪、牛等多种动物体内分离到这种细菌，发病率及死亡率极高[5-6]。

细菌分泌系统将分泌性蛋白质或毒素转运到胞外是细菌实现致病性的关键环节。胞外分泌蛋白包含许多种酶类物质，如核酸酶、胶原酶、蛋白酶、几丁质酶和透明质酸酶等[7]。微生物胞外蛋白核酸酶在细菌和宿主之间的相互作用过程中发挥重要作用[8-9]。病原体感染宿主细胞的过程中，DNA和RNA可被核酸酶水解消化成寡核苷酸，以此作为微生物生存的营养物质。同时，胞外核酸酶可降解宿主细胞表面的黏性分泌物，使得细菌更容易黏附到细胞表面，有助于细菌感染宿主[10]。因此，致病性病原体的胞外核酸酶是一种重要的毒力因子[11-12]。探究细菌胞外核酸酶有助于揭示微生物病原体的致病机制，但目前尚未见关于肺炎克雷伯菌胞外分泌蛋白核酸酶活性研究的报道。为此，对河南某养殖场患肺炎的水貂死亡病例进行细菌的分离鉴定，并对分离菌株进行胞外分泌蛋白提取，研究其胞外分泌蛋白的核酸酶活性，以期为进一步研究肺炎克雷伯菌的致病性奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试剂

胰蛋白胨、酵母浸出物等购自英国OXOID公司；琼脂粉购自博奥森生物股份有限公司；λDNA和BCA蛋白质定量分析试剂盒均购自生工生物工程(上海)股份有限公司；琼脂糖、核酸染料、氯化钠等购自北京索莱宝科技有限公司；DNase Ⅰ购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.2 病原菌的分离

无菌采集患肺炎水貂的淋巴结、肾脏、脾脏、肝脏、肺脏病料样品，划线接种于西蒙式枸橼酸盐琼脂培养基(SCA)平板上，置于37 ℃培养16～24 h，观察细菌生长状况。

1.3 病原菌的鉴定

挑取纯培养单菌落，制备菌悬液，利用肺炎克雷伯菌的16S rRNA通用引物进行PCR扩增检测。反应体系：10×PCR Buffer 5.0 μL、dNTP(2.5 μmol/L)4.0 μL、上下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL、模板1.0 μL、TaqDNA聚合酶(5 U/μL) 0.5 μL,补去离子水至50 μL。反应条件：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性50 s，57 ℃退火50 s;72 ℃延伸50 s，30个循环;72 ℃延伸10 min。反应结束后，取5～8 μL PCR产物用10 g/L的琼脂糖凝胶进行电泳检测。

1.4 肺炎克雷伯菌胞外分泌蛋白的收集

将肺炎克雷伯菌划线接种于LB固体平板，37 ℃培养箱培养24 h后挑取单个菌落于LB液体培养基中，37 ℃条件下 180 r/min振荡培养18 h。将培养液按1∶10比例接种于LB液体培养基中，37 ℃条件下 180 r/min振荡培养6 h,离心收取上清液。利用透析袋多次透析收集胞外分泌蛋白，经BCA蛋白质定量分析法测定蛋白质浓度，置-80 ℃备用。

1.5 胞外分泌蛋白核酸酶活性的测定

按下列参数配制肺炎克雷伯菌胞外分泌蛋白降解DNA的50 μL酶切体系：磷酸盐缓冲液(1 L中含量分别为NaCl 7.9 g、KCl 0.2 g、Na2HPO41.44 g、K2HPO41.8 g)5 μL、λDNA(0.1 g/L)1 μL、肺炎克雷伯菌胞外分泌蛋白5 μL，补充ddH2O至总体积为50 μL。于37 ℃水浴锅中进行酶切反应，利用1.0%琼脂糖凝胶电泳分析酶切情况。

1.6 温度对胞外蛋白核酸酶活性影响的测定

按照1.5中的方法观察温度对肺炎克雷伯菌胞外分泌蛋白降解λDNA的影响，温度设置4、16、25、30、37、42、50、60 ℃。同时，按照同样方法检测胞外分泌蛋白核酸酶活性的热稳定性，胞外分泌蛋白分别经65、70、75、80 ℃预处理20 min，并保持其他参数不变，凝胶成像系统分析酶切变化情况。

1.7 pH值对胞外分泌蛋白核酸酶活性影响的测定

按照1.5中的方法观察pH值对肺炎克雷伯菌胞外分泌蛋白降解λDNA的影响，pH值设置3.0(乙酸盐缓冲液)、4.0(甲苯酸盐缓冲液)、5.0(醋酸盐缓冲液)、6.0(柠檬酸盐缓冲液)、7.0(磷酸盐缓冲液)、8.0(Tris缓冲液)、9.0(硼酸盐缓冲液)和10.0(甘氨酸缓冲液)，并保持其他参数不变，凝胶成像系统分析酶切变化情况。

1.8 金属离子对胞外分泌蛋白核酸酶活性影响的测定

按照1.5中的方法观察金属离子(Na+、K+、Zn2+、Co2+、Mn2+、Ba2+、Ca2+、Cu2+、Fe3+、Mg2+和Ni2+)对肺炎克雷伯菌胞外分泌蛋白降解λDNA的影响，配制含终浓度分别为0.01、0.10、1.00、5.00、10.00 mmol/L金属离子的50 μL反应体系，并保持其他参数不变，凝胶成像系统分析酶切变化情况。

2 结果与分析

2.1 病原菌的分离与鉴定

无菌取患肺炎死亡水貂的淋巴结、肾脏、脾脏、肝脏、肺脏等样品进行细菌分离，经纯化得到1株菌株。分离菌株在西蒙式枸橼酸盐琼脂培养基(SCA)上形成较小的蓝色菌落，显微镜观察分离菌为两极浓染的革兰氏阴性粗短杆菌。对菌落进行16S rRNA PCR扩增(图1)，经鉴定为肺炎克雷伯菌。

M：DL2000 Marker；1：目的基因；2：阴性对照M:DL2000 Marker;1:Objective gene; 2:Negative control图1 肺炎克雷伯菌的PCR鉴定Fig.1 PCR indentification of Klebsiella pneumoniae

2.2 胞外分泌蛋白的核酸酶活性

为测定肺炎克雷伯菌胞外分泌蛋白的核酸酶活性，琼脂糖凝胶电泳观察不同浓度的胞外分泌蛋白降解λDNA情况。结果显示，DNase Ⅰ阳性对照组的λDNA完全被降解，胞外分泌蛋白与λDNA孵育后同样表现出降解现象，1 g/L的胞外分泌蛋白就可降解λDNA，并且随着肺炎克雷伯菌胞外分泌蛋白质量浓度的增加，λDNA的条带逐渐变淡，而培养基阴性对照组的λDNA则未被降解(图2)。可见,肺炎克雷伯菌胞外分泌蛋白具有切割DNA的核酸酶活性。

1：λDNA；2：DNase Ⅰ+λDNA；3：培养基+λDNA；4—9：分别为1、2、3、4、5、6 g/L胞外分泌蛋白+λDNA1:λDNA;2:DNase Ⅰ+λDNA;3:Medium+λDNA;4—9:The extracellular proteins with concentration of 1,2,3,4,5,6 g/L +λDNA图2 胞外分泌蛋白核酸酶活性的测定Fig.2 Determination of the nuclease activity of the extracellular proteins

2.3 温度对肺炎克雷伯菌胞外分泌蛋白核酸酶活性的影响

将胞外蛋白和λDNA共孵育，分别在4、16、25、30、37、42、50、60 ℃下进行酶切反应，然后采用琼脂糖凝胶电泳检测温度对肺炎克雷伯菌分泌蛋白核酸酶活性的影响。结果显示，不同孵育温度下λDNA均可被胞外分泌蛋白降解，4、16、50、60℃时胞外分泌蛋白核酸酶的活性稍差，而25、30、37、42 ℃时胞外分泌蛋白核酸酶的活性较强，且30 ℃和37 ℃时胞外分泌蛋白具有很强的核酸酶活性(图3A)。同时，胞外分泌蛋白的热稳定性试验结果显示，胞外分泌蛋白经65 ℃以上温度处理后处于失活状态(图3B)。以上结果表明，30～37 ℃是肺炎克雷伯菌胞外分泌蛋白核酸酶活性的最适温度。

2.4 pH值对肺炎克雷伯菌胞外分泌蛋白核酸酶活性的影响

将肺炎克雷伯菌胞外分泌蛋白和λDNA共孵育，分别在pH值3.0～10.0环境下进行酶切反应，然后采用琼脂糖凝胶电泳检测pH值对肺炎克雷伯菌胞外分泌蛋白核酸酶活性的影响。结果显示，不同pH值反应环境下λDNA均可被胞外分泌蛋白降解，pH值为7.0时胞外分泌蛋白切割λDNA的能力最强，在pH值4.0～7.0的酸性环境下具有良好的核酸酶活性，而在pH值8.0～10.0的碱性条件下胞外分泌蛋白核酸酶活性较差(图4)。以上结果表明，pH值7.0是肺炎克雷伯菌胞外分泌蛋白核酸酶活性的最适pH值。

A:不同反应温度下胞外分泌蛋白核酸酶活性;B:胞外分泌蛋白核酸酶活性的耐热性检测A:Activity of extracellular secretory protein nuclease at different reaction temperatures;B:Detection of thermostability of exocrine protein nuclease activity图3 温度对胞外分泌蛋白核酸酶活性的影响Fig.3 Effect of temperature on the nuclease activity of the extracellular proteins

图4 pH值对胞外分泌蛋白核酸酶活性的影响Fig.4 Effect of pH value on the nuclease activity of the extracellular proteins

2.5 金属离子对肺炎克雷伯菌胞外分泌蛋白核酸酶活性的影响

将胞外分泌蛋白和λDNA共孵育，分别在酶切反应体系中添加0.01、0.10、1.00、5.00、10.00 mmol/L的金属离子(Na+、K+、Zn2+、Co2+、Mn2+、Ba2+、Ca2+、Cu2+、Fe3+、Mg2+和Ni2+)，然后采用琼脂糖凝胶电泳检测金属离子对肺炎克雷伯菌胞外分泌蛋白降解λDNA的影响(图5)。结果显示，一价金属离子方面，0.01～10.00 mmol/L的Na+和K+对胞外分泌蛋白的核酸酶活性无影响。整体上分析，0.01～10.00 mmol/L的大多数二价金属离子(Ca2+、Ba2+、Ni2+、Zn2+和Cu2+)对胞外分泌蛋白的核酸酶活性无显著影响；低浓度(0.01～1.00 mmol/L)的Co2+对胞外分泌蛋白的核酸酶活性无明显影响，但高浓度(5.00～10.00 mmol/L)的Co2+可以促进胞外核酸酶切割λDNA的活性；0.01～5.00 mmol/L的Mg2+和Mn2+对胞外分泌蛋白的核酸酶活性无明显影响，但10.00 mmol/L的Mg2+和Mn2+可以促进胞外核酸酶切割λDNA的活性。三价金属离子Fe3+在0.01～1.00 mmol/L时对胞外分泌蛋白的核酸酶活性无明显影响，但5.00～10.00 mmol/L的Fe3+可以促进胞外核酸酶切割λDNA的活性。

1：λDNA；2.DNase Ⅰ+DNA;3：胞外分泌蛋白+λDNA；4—8：分别为0.01、0.10、1.00、5.00、10.00 mmol/L金属离子+胞外分泌蛋白+λDNA1:λDNA;2.DNase Ⅰ+DNA;3:The extracellular proteins +λDNA;4—8:The metal ions with concentration of 0.01,0.10,1.00,5.00,10.00 mmol/L + the extracellular proteins +λDNA图5 金属离子对胞外分泌蛋白核酸酶活性的影响Fig.5 Effect of metal ions on the nuclease activity of the extracellular proteins

3 结论与讨论

肺炎克雷伯菌是一种条件致病性的人兽共患病原菌。近几年，由该菌引起毛皮动物(狐狸、水貂及貉)发病的案例逐渐增多，严重威胁着养殖业的发展[13-14]。2019年4月，河南某水貂养殖场发生以采食量下降、呼吸困难为特征的急性传染病。解剖发现，病亡水貂气管内轻微出血，肺脏大面积淤血、出血，肺门淋巴结肿大出血。通过病料涂片镜检、病原菌分离纯化及PCR鉴定，表明分离菌株为肺炎克雷伯菌，并对该菌胞外分泌蛋白的核酸酶活性进行研究。

病原微生物分泌的胞外蛋白是重要的致病因子之一，常被作为研究病原微生物致病机制的靶标。本研究通过琼脂糖凝胶电泳法证实了肺炎克雷伯菌分泌的胞外蛋白具有核酸酶活性，并探究了温度、金属离子和pH值对肺炎克雷伯菌胞外分泌蛋白核酸酶活性的影响。微生物产生的核酸酶通常在pH值介于6.0～10.0时具有较好活性，尤其在pH值为8.0～8.5时活性最高[15-16]。本研究发现，肺炎克雷伯菌胞外分泌蛋白在pH值为7.0的中性条件下核酸酶活性最强，而在pH值3.0～7.0的酸性环境中胞外蛋白的核酸酶活性较强，说明肺炎克雷伯菌胞外蛋白中含依赖碱性的核酸酶少。同时，本研究发现，肺炎克雷伯菌胞外分泌蛋白在25～42 ℃表现出较好的核酸酶活性，且30～37 ℃是肺炎克雷伯菌胞外分泌蛋白发挥核酸酶活性的最适温度，这与文献报道的常见微生物胞外核酸酶在35～44 ℃表现出较高活性基本一致[17]。

辅酶、辅基和激活剂等辅助因子是一些酶发挥活性所需要的非蛋白质成分。金属离子作为激活剂对酶促反应影响的动力学非常复杂[18]。在酶促反应方面，Mg2+、Zn2+、Mn2+和Ca2+等是最常见的二价金属离子。一般来说，金属离子既能增强底物对序列或结构特异性的核酸酶的亲和力，也能直接参与磷酸键断裂的催化作用[12]。Ca2+和Mg2+对于大多数核酸酶的活性是必需的[19]。本研究中，一价金属离子(Na+和K+)和某些二价金属离子(Ca2+、Ba2+、Ni2+、Zn2+和Cu2+)对肺炎克雷伯菌胞外分泌蛋白的核酸酶活性无明显影响。一般情况下，适当的金属离子浓度有助于酶促反应，但过量的离子浓度反而会抑制酶反应速度。本研究中，5.00～10.00 mmol/L的Co2+和Fe3+以及10.00 mmol/L的Mg2+和Mn2+可以促进胞外核酸酶切割λDNA的活性。综上，肺炎克雷伯菌胞外分泌蛋白可能具有多种核酸酶。

前人研究发现，病原微生物分泌胞外核酸酶是逃避宿主免疫杀伤的主要途径之一[20]。本研究也证实了肺炎克雷伯菌胞外蛋白的核酸酶活性，但推测肺炎克雷伯菌分泌的胞外蛋白可能包含多种核酸酶。基于此，下一步需要对肺炎克雷伯菌胞外蛋白核酸酶的种类及其特性和功能展开研究，从而有助于揭示胞外核酸酶在肺炎克雷伯菌的致病性和免疫逃逸中的确切作用。