粮食脂肪酸值测定影响因素分析及优化

李维香 张继光 吴万富 吕世懂

(昆明市粮油饲料产品质量检验中心，昆明 650118)

脂肪酸值是衡量粮食游离脂肪酸含量的指标，游离脂肪酸是粮食及其加工制品中脂肪氧化分解产生的。粮食脂肪酸值测定在粮食质量检验工作中占有非常重要的地位，是稻谷、玉米储存品质检验的关键性指标，在保障储备粮质量安全工作中占有举足轻重的地位；是衡量小麦粉品质优劣的重要指标，它反映了小麦粉的新鲜程度。随着粮食储藏时间、储藏环境温度、湿度、加工方式的变化，粮食及其加工制品中游离脂肪酸的含量都会发生变化，根据脂肪酸值的变化可以判断储存粮食的陈化程度、小麦粉等粮食加工制品的品质变化情况，因此脂肪酸值是衡量粮食劣变过程的主要指标。由于脂肪酸值测定影响因素较多，干扰了脂肪酸值测定的准确性、可靠性。这些因素主要包括样品的粉碎方式、粉碎细度、粉碎样品的放置时间、环境温度、样品提取时间、滤液静置时间、标准溶液、测定用水、终点判定等，这些影响因素前人已进行过很多研究，庞文禄[1]研究了样品粉碎方式、粉碎细度、环境温度、样品提取时间、滤液静置时间等对脂肪酸值测定结果的影响；杨军等[2]探讨了样品粉碎细度、粉碎磨升温、标液浓度、样品提取时间、滤液静置时间等对脂肪酸值测定结果的影响；王茜茜等[3]研究了粉碎后的样品放置时间对脂肪酸值测定结果的影响。为消除这些影响，脂肪酸值测定方法标准GB/T 20569—2006《稻谷储存品质判定规则》[4]、GB/T 20570—2015《玉米储存品质判定规则》[5]、GB/T 5510—2011《粮油检验 粮食、油料脂肪酸值测定》[6]、GB/T 29405—2012《粮油检验 谷物及制品脂肪酸值测定 仪器法》[7]、GB/T 15684—2015 《谷物碾磨制品 脂肪酸值的测定》[8]对测定条件都作了明确的规定。通过对振荡器振幅、指示剂、测定用水、标准溶液对粮食脂肪酸值测定的影响进行深入分析，本研究对现行粮食脂肪酸值测定方法进行优化。

1 材料与方法

1.1 仪器

916 Ti-Touch自动电位滴定仪，水相酸碱滴定专用复合pH电极，10 mL碱式滴定管：最小分度值0.05 mL；振幅30 mm的往复式振荡器，振幅20 mm的往复式振荡器，3100锤式旋风磨。

1.2 试剂

无水乙醇(AR)、95%乙醇(AR)、酚酞(AR)、百里香酚蓝(AR)、N,N-二甲基甲酰胺(AR)、百里香酚蓝指示剂：1.0%，称取1.0 g百里香酚蓝,用少量N,N-二甲基甲酰胺溶解，再用95%乙醇定容到100 mL，密闭放置24 h备用；酚酞指示剂：1.0%，称取1.0 g酚酞溶于100 mL 95%乙醇中；0.01 mol/L的95%乙醇溶剂氢氧化钾标准滴定溶液：参照GB/T 20569—2006配制；0.01 mol/L的水溶剂氢氧化钾标准滴定溶液：参照GB/T 601—2016[9]配制。

1.3 样品

稻谷和玉米样品来自粮食储备库；小麦粉样品来自市售商品小麦粉；红米稻、红玉米等“有色”粮食来自粮食收储企业。

1.4 脂肪酸值测定方法

手工滴定法：参照GB/T 20569—2006执行。振荡提取时间：稻谷10 min，玉米30 min，小麦粉40 min。用百里香酚蓝作为指示剂时，加3滴百里香酚蓝指示剂于提取液中，待测液变为黄色，当滴定液从黄色变为微蓝色30 s不消失即为滴定终点。

电位滴定法：GB/T 29405—2012第二法。振荡提取时间：稻谷10 min，玉米30 min，小麦粉40 min。仪器参数设置：采用预设终点pH滴定模式(SET-pH)测定脂肪酸值，滴定过程以酚酞指示剂进行监测。自动电位滴定仪参数设置为终点pH：9.25～9.35；平衡时间：10 s；最大滴定速度：10 mL/min；最小滴定速度：10 μL/min；动态范围：4.0；停止判据：漂移；停止漂移：20 μL/min；搅拌速度：8。自动电位滴定仪参数设置方法为用酚酞指示剂监测终点，以微红30 s不消失为空白滴定终点，以明显有色差为样液滴定终点。

1.5 数据处理方法

参照LS/T 6402—2017[10]执行。

2 结果与分析

2.1 振荡器的振幅对脂肪酸值测定的影响

GB/T 20569—2006、GB/T 20570—2015、GB/T 5510—2011、GB/T 29405—2012规定脂肪酸提取采用的振荡器为往复式，振荡频率为100 次/min，未明确振荡器的振幅。

采用电位滴定法进行实验。为了考察不同振幅的振荡器对测定结果的影响，选择稻谷、玉米、小麦粉样品各8份，分别用振幅为30、20 mm，振荡频率为100次/min的不同振荡器提取脂肪酸，比较脂肪酸值测定结果。采用配对t检验，考察用不同振幅的振荡器提取的样品溶液，测定结果是否存在显著性差异。比较结果见表1。

表1 振荡器振幅对粮食脂肪酸值测定结果影响比较

由表1可知，在95%置信概率下，配对t检验的计算值td=8.753，远高于查表值t0.05,23=2.068 7，表明30 mm振幅与20 mm振幅的振荡器提取法之间存在显著性差异。30 mm振幅振荡器提取法显著高于20 mm振幅振荡器提取法的测定数据，24份样品平均为0.72 mgKOH/100 g。表明脂肪酸的提取率与振荡器的振荡强度有关，振幅越大，振荡强度就越大，提取率也越高。因此，在测定方法中，应明确所选用振荡器的振幅。往复式振荡器的振荡频率为100 次/min，稻谷提取时间为10 min、玉米为30 min、小麦粉为40 min时，宜选用振幅为20 mm的振荡器。

2.2 百里香酚蓝指示剂与酚酞指示剂测定结果比较

GB/T 20569—2006、GB/T 20570—2015中，手工滴定法以酚酞指示剂测定脂肪酸值，一是待测液中的酸为有机弱酸，用强碱滴定弱酸突变不显著；二是粮食本身色素的影响，以“微红”判定终点，往往滴定过量。在实际操作中，通常以“色差”来判定终点，但因样品基质的干扰，样液往往混浊而掩盖了这种变化；不同操作者对颜色的敏感度存在差异，对色差变化的观察不一致，造成不同操作者对同一样品的测定误差较大，影响了测定结果的准确性。

为改进脂肪酸滴定的终点判定，不少学者从多方向开展了研究。盖泽广[11]提出用百里香酚蓝指示剂代替酚酞指示剂测定粮食脂肪酸值，并进行了初步研究。粮食中的脂肪酸是有机弱酸，用强碱滴定，突跃范围pH值8.0～9.7。酞酚的变色范围pH值8.0～10.0，由无色变为浅红色。百里香酚蓝有两个变色范围，一个变色范围pH值1.2～2.8，由红色变为黄色，粮食脂肪酸提取溶液的pH值一般都超过3，所以加入百里香酚蓝指示剂，溶液即变为黄色；另一个变色范围pH值8.6～9.6，由黄色变为蓝色。两种指示剂的变色范围都恰好在滴定脂肪酸的突跃范围内，因此，用百里香酚蓝代替酞酚指示剂滴定脂肪酸是可行的。

在参考文献的基础上，选择百里香酚蓝代替酚酞指示剂开展进一步研究，以改进终点判定的稳定性。酚酞指示剂法采用电位滴定，以微红或明显色差30 s不消失为滴定终点；百里香酚蓝指示剂法采用手工滴定，以微蓝30 s不消失为滴定终点。选择稻谷、玉米、小麦粉样品各8份，分别用两种滴定方法测定脂肪酸值。采用配对t检验，考察不同指示剂滴定的结果是否存在显著性差异。比较结果见表2。

表2 百里香酚蓝指示剂滴定法与酚酞指示剂滴定法测定粮食脂肪酸值结果比较

由表2可知，在95%置信概率下，配对t检验的计算值td=1.566，远小于查表值t0.05,23=2.068 7，表明百里香酚蓝指示剂滴定法与酚酞指示剂滴定法测定粮食脂肪酸值之间不存在显著性差异，可以用百里香酚蓝指示剂代替酚酞指示剂测定粮食脂肪酸值。

选择 “有色”粮食样品8份，分别用电位滴定法和百里香酚蓝指示剂手工滴定法测定脂肪酸值，采用配对t检验考察两种方法的测定结果的显著性差异。比较结果见表3。

表3 百里香酚蓝指示剂手工滴定法与电位滴定法测定“有色”粮食脂肪酸值结果比较

由表3可知，在95%置信概率下，配对t检验的计算值td=0.401，远小于查表值t0.05,7=2.364 6，表明百里香酚蓝指示剂滴定法与国标电位滴定法之间不存在显著性差异，即百里香酚蓝指示剂手工滴定法还可以测定“有色”粮食的脂肪酸值。

用百里香酚蓝指示剂测定脂肪酸，颜色从黄色变为微蓝色，其变化过程为先褪色后变色，颜色变化比较明显，易于观察，解决了酚酞指示剂终点判定难导致测定结果不稳定的问题；百里香酚蓝指示剂独特的变色过程，还适用于测定黑米稻、紫米稻、红米稻、红玉米、黑玉米等“有色”粮食的脂肪酸值，测定方法的应用范围更为广泛。

2.3 不同实验用水测定结果比较

为了消除测定过程CO2对测定结果的影响，GB/T 20569、GB/T 20570规定脂肪酸值测定用水为现制不含CO2的蒸馏水，操作繁琐，用时长，影响测定效率。研究发现，测定过程要扣除空白，可以消除CO2的影响。

比较用现制不含CO2的蒸馏水、10 d前制备的密闭存放的不含CO2的蒸馏水、三级水测定结果，以判断不同水质对测定脂肪酸值的影响，结果见表4、表5。

表4 密闭存放的不含CO2蒸馏水与现制不含CO2的蒸馏水测定粮食脂肪酸值结果比较

表5 三级水与现制不含CO2的蒸馏水测定粮食脂肪酸值结果比较

由表4、表5可知，在95%置信概率下，配对t检验的计算值td分别为0.258、1.918，都远小于查表值t0.05,8=2.306 0。表明用10 d前制备的密闭存放的不含CO2的蒸馏水、三级水与现制不含CO2的蒸馏水测定粮食脂肪酸值之间不存在显著性差异，可以用密闭存放的不含CO2的蒸馏水或三级水代替现制不含CO2的蒸馏水测定粮食脂肪酸值。

2.4 水溶剂氢氧化钾标准滴定溶液与95%乙醇溶剂氢氧化钾标准滴定溶液测定结果比较

GB/T 20569、GB/T 20570、GB/T 5510、GB/T 15684、GB/T 29405等都规定以95%乙醇溶剂氢氧化钾标准滴定溶液测定脂肪酸值。乙醇溶剂氢氧化钾标准滴定溶液稳定性差，容易变性，使标准滴定溶液浓度快速下降。现配滴定溶液繁琐，且测定过程稍长，就容易导致测定值偏高。尝试用0.01 mol/L的水溶剂氢氧化钾标准滴定溶液取代0.01 mol/L的95%乙醇溶剂氢氧化钾标准滴定溶液测定脂肪酸值。

2.4.1 水溶剂与95%乙醇溶剂氢氧化钾标准滴定溶液测定结果比较

选择稻谷、玉米、小麦粉样品各4份，分别用水溶剂和95%乙醇溶剂氢氧化钾标准滴定溶液测定脂肪酸值，测定结果及分析见表6。

表6 水溶剂与95%乙醇溶剂氢氧化钾标准滴定溶液测定粮食脂肪酸值结果比较

由表6可知，在95%置信概率下，配对t检验的计算值td=0.481，远小于查表值t0.05,11=2.201 0，表明用0.01 mol/L的水溶剂与95%乙醇溶剂氢氧化钾标准滴定溶液测定脂肪酸值之间不存在显著性差异。可以用水溶剂氢氧化钾标准滴定溶液取代95%乙醇溶剂氢氧化钾标准滴定溶液测定粮食脂肪酸值。

2.4.2 水溶剂与95%乙醇溶剂氢氧化钾标准滴定溶液稳定性比较

2.4.2.1 长期稳定性比较

用1个月前配制并在室温25 ℃以下密闭放置的标准滴定溶液与现配制的标准滴定溶液测定粮食脂肪酸值，比较测定结果的差异，考察标准滴定溶液的长期稳定性，见表7、表8。

表7 1个月前配制与现配制的水溶剂氢氧化钾标准滴定溶液测定粮食脂肪酸值结果比较

表8 1个月前配制与现配制的95%乙醇溶剂氢氧化钾标准滴定溶液测定粮食脂肪酸值结果比较

在95%置信概率下，1个月前配制并密闭放置的与现配制的水溶剂氢氧化钾标准滴定溶液测定结果比较，配对t检验的计算值td为1.786，小于查表值t0.05,7=2.364 6，表明用1个月前配制并在室温下密闭放置的与用现配制的水溶剂标准滴定溶液测定粮食脂肪酸值之间不存在显著性差异，即密闭放置1个月的水溶剂氢氧化钾标准滴定溶液浓度未发生显著性变化。

由表8可知，在95%置信概率下，1个月前配制并密闭放置的与现配制的95%乙醇溶剂标准滴定溶液测定结果比较，配对t检验的计算值td=3.808，远大于查表值t0.05,7=2.364 6，表明用1个月前配制并在室温下密闭放置的与用现配制的95%乙醇溶剂氢氧化钾标准滴定溶液测定粮食脂肪酸值之间存在显著性差异，测定值平均为2.69 mgKOH/100 g，即密闭放置1个月的95%乙醇溶剂氢氧化钾标准滴定溶液的浓度已显著降低。

2.4.2.2 短期稳定性比较

分别用在室温下(20±5) ℃半敞口放置的水溶剂和95%乙醇溶剂氢氧化钾标准滴定溶液每隔1 h对同一样品提取液测定一次脂肪酸值作为实验组，并用密闭放置的现配标准滴定溶液每隔1 h对同一样液测定一次脂肪酸值作为对照组，连续测定5 h，用实验组测定值与对照组测定值之差考察两种溶剂标准滴定溶液的短期稳定性。见表9和图1。

表9 半敞口放置的水溶剂和95%乙醇溶剂标准滴定溶液不同放置时间测定结果与对照组比较变化情况

图1 半敞口放置的水溶剂和95%乙醇溶剂标准滴定溶液不同放置时间测定结果与对照组比较变化关系图

表9和图1显示，随着放置时间的增加，试验组的测定值也增加，表明标准滴定溶液的实际浓度逐渐下降。半敞口放置的水溶剂氢氧化钾标准滴定溶液测定值随放置时间的上升要比95%乙醇溶剂氢氧化钾标准滴定溶液的测定值随放置时间的上升要慢得多，即在室温下(20±5) ℃半敞口放置的水溶剂氢氧化钾标准滴定溶液比同样条件下放置的95%乙醇溶剂氢氧化钾标准滴定溶液的浓度下降缓慢。

结果表明，水溶剂氢氧化钾标准滴定溶液的长期稳定性和短期稳定性比95%乙醇溶剂氢氧化钾标准滴定溶液高，更适宜用作粮食脂肪酸值测定的标准滴定溶液。

2.5 脂肪酸值测定方法的优化

分别用百里香酚蓝指示剂、三级水、水溶剂氢氧化钾标准滴定溶液代替现行国标方法中的酚酞指示剂、现制不含CO2蒸馏水、95%乙醇溶剂氢氧化钾标准滴定溶液测定稻谷、玉米、小麦粉的脂肪酸值进行比较，结果及分析见表10。

表10 优化后与优化前的脂肪酸值测定方法测定结果比较

在95%置信概率下，配对t检验的计算值td=0.105，远小于查表值t0.05,8=2.306 0，表明优化后与优化前的测定方法之间不存在显著性差异。但优化后的测定方法操作更为简便、终点更易识别、测定更为稳定、适用范围更广、测定效率更高。

3 结论

不同振幅的振荡器对粮食脂肪酸值的提取率造成显著影响。在测定粮食脂肪酸值时应当关注所使用振荡器的振幅，并在测定方法中明确振荡器的振幅。

用百里香酚蓝和用酚酞作为指示剂测定粮食脂肪酸值结果不存在显著差异。但用百里香酚蓝作为指示剂终点更易观察，适用范围更广。

用水溶剂氢氧化钾标准滴定溶液和95%乙醇溶剂氢氧化钾标准滴定溶液测定粮食脂肪酸值结果不存在显著差异。但水溶剂氢氧化钾标准滴定溶液的长期、短期稳定性更高，使用水溶剂标准滴定溶液可以简化配制程序，测定更为简便，并能提高测定结果的准确性。

在现行国标中，用三级水代替现制不含 CO2蒸馏水、用百里香酚蓝指示剂代替酚酞指示剂、用水溶剂氢氧化钾标准滴定溶液代替95%乙醇溶剂氢氧化钾标准滴定溶液，可以使方法得到极大优化。一是简化了操作过程，有利于提高测定效率；二是解决目前国标手工滴定法“终点判定难”的问题，使终点判定变得容易，同时提高了方法的适用范围，使手工滴定法不仅适用于普通粮食，还适用于“有色”粮食的脂肪酸值测定；三是解决了95%乙醇溶剂氢氧化钾标准滴定溶液不稳定的问题，间接提高测定结果的准确性和稳定性。经优化后的方法具有较高的推广价值。