富硒大豆低聚肽的制备及其抗疲劳功能的研究

白海军

(黑龙江八一农垦大学，大庆 163319)

硒元素是一种具有较强抗氧化能力且人体所必需的微量营养元素，它能够有效预防癌症、防治多种心脑血管慢性疾病[1]。由于硒元素在地壳中分布不均，部分国家或地区的人们会出现硒缺乏症，需要通过膳食或药物干预防治硒缺乏症。除这部分人群外，研究表明竞技型运动员会由于长期训练导致血硒含量降低，因而体力型劳动从业者也需要服用硒补充剂，防止由缺硒所导致的疲劳氧化损伤从而缓解运动性疲劳[2]。硒补充剂分两大类：无机硒补充剂主要为硒酸盐，它毒性较大、生物利用率低，而富含有机硒的富硒农产品相较之下是一种安全、可靠适用人群更广的硒营养补充品[3]。富硒农产品的生产主要在富硒土壤地区栽培作物，或是在栽培作物的过程中进行叶面施洒无机硒肥料。大豆是一种可聚硒的优质蛋白质植物资源，它能根据环境中无机硒的含量通过转运途径转化为有机硒，并以硒结合蛋白的形式存在于大豆蛋白中[4]。高思薇等[5]研究发现，富硒大豆蛋白酶解后硒蛋白含量更高，在饲喂等量硒元素条件下富硒低聚肽能使血硒更快达到峰值。此外，大豆低聚肽易吸收且具有抗氧化、抗疲劳活性等，但它在原蛋白质序列中并不能显现出活性[6]。因而，通过酶解处理富硒大豆蛋白制备富硒大豆低聚肽，不但能够促进硒元素在小肠中的吸收，同时还能进一步提高抗氧化、抗疲劳活性。

根据疲劳产生的“自由基理论”，机体疲劳的产生主要是由于体内活性氧自由基的生成和清除速率失衡，致使活性氧蓄积机体处于氧化应激状态，从而造成脂质过氧化损伤等一系列副反应，抗过氧化损伤是疲劳缓解与恢复的重要因素。研究表明硒是机体抗氧化物酶的重要组成，体现在硒蛋白参与构成的酶中，作为谷胱甘肽过氧化物酶的活性中心，主要以硒代半胱氨酸形式存在[7]。郭建军[8]研究发现，长期训练的小鼠在高强度运动下硒元素能显著提高谷胱甘肽过氧化物酶的活性，从而使机体抗脂质过氧化能力增强。刘丹等[9]发现富硒麦芽能够延长小鼠的游泳时间。

目前，国内外对于富硒大豆低聚肽的抗氧化活性研究较为充分，但其抗疲劳活性的相关研究并不完善，本实验拟采用富硒大豆为原料制备富硒大豆蛋白低聚肽，并通过电感耦合等离子体质谱法对低聚肽中硒的含量、形态进行测定，在此基础上建立运动性疲劳小鼠模型，通过负重力竭游泳实验以及肝糖原、肌糖原、血清中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、丙二醛生化指标，对富硒大豆低聚肽的抗运动性疲劳功能进行研究，以期以富硒大豆低聚肽为原材料的抗疲劳类保健品的开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级昆明种雄性健康小鼠60只，个体质量约(20±2.0)g，购自东北农业大学动医学院实验动物中心，饲养期间给予啮齿类动物标准颗粒饲料及自由饮水，恒定湿度55%，室温(25±1) ℃，自由进食一周后应用于实验研究。

1.2 材料与试剂

东升1号富硒大豆、中性蛋白酶(Neutrase)、风味蛋白酶(Flavourzyme)、PLBC07610millipore超滤膜-3 ku、生化指标检测试剂盒；其他所用试剂为分析纯。

1.3 仪器与设备

BHS-2恒温水浴锅，7500c型电感耦合等离子体质谱，LC-1200型液相色谱，FC酶标仪，磁力搅拌器，德国IKA公司，UV-2600紫外可见分光光度计，恒温游泳池。

1.4 富硒大豆低聚肽的制备

1.4.1 富硒大豆蛋白的制备

富硒大豆蛋白的制备参考文献[10]稍作修改，清理新鲜大豆后粉碎过80目筛网，用正己烷脱脂后将富硒大豆粉与去离子水溶解后，调节溶液pH值至4.5沉淀蛋白质，4 ℃条件下8 000 r/min离心20 min去除上清液后调节溶液pH值至7.0使蛋白质沉淀溶解，冷冻干燥后于密封袋中-20 ℃保存。

1.4.2 富硒大豆低聚肽的制备

富硒大豆低聚肽的制备参考董砚博[11]的方法稍加修改，采用双酶酶解法提高大豆低聚肽的产率，具体操作如下，配置5%的富硒大豆蛋白溶液，向溶液中加入中性蛋白酶(400 U/g)和风味蛋白酶(200U/g)，在50 ℃下酶解3 h，灭酶后在4 ℃条件下8 000 r/min离心20 min取上清液，超滤后冷冻干燥后于密封袋中-20 ℃保存。蛋白质含量的测定参考GB 5009.5—2010《食品中蛋白的测定》，采用微量凯氏定氮法进行计算。

1.5 硒含量的测定

总硒元素测定参考GB5009.268—2016。低聚肽中硒形态的测定采用电感耦合等离子体质谱法参考文献[12]，将0.5 g的大豆低聚肽、2.0 mL的H2O2、10.0 mL的HNO3于消化管中充分混合，于微波消解仪中消化后定容至容量瓶中。进样体积10 μL，等度洗脱，流动相A为95%水，流动相B为5%甲醇，流速0.8 mL/min，洗脱时间20 min。

1.6 动物实验

1.6.1 动物模型的建立

将60只健康雄性小鼠随机分为6组，设立对照组、模型组、富硒大豆低聚肽低/高剂量组(SeP-L/H)、大豆低聚肽低/高剂量组(P-L/H)。采用灌胃法给予样品容量均0.2 mL/d，模型组、对照组给予等量生理盐水，大豆低聚肽剂量组分别设置为20、100 mg/(kgbw·d)两个剂量组。动物模型的建立如下：在实验第1周进行适应性游泳训练，除除模型组外，其余6组小鼠在第1周每日游泳训练10 min，第2周训练15 min，第3周负重自身体重5%训练至力竭，实验7 d为1周期，每隔6 d休息1 d，每周称重，约21 d后小鼠出现动作迟缓、鼠毛稀疏、食欲减退等典型运动性疲劳行为学异常状况。

1.6.2 负重力竭游泳实验

末次给予样品30 min后，将小鼠置于(25±1)℃的恒温游泳箱中，鼠尾根部负荷约体重5%的铅皮，记录小鼠自游泳开始至力竭的时间(min)。当小鼠完全下沉至水面下超过10 s且捞出后无法完成翻正反射，即为力竭。

1.7 生化指标检测方法

在力竭游泳实验结束后立即将小鼠断颈处死，眼球取血并将采集到的新鲜血液于4℃静置1 h后，在3 000 r/min条件下分离15 min取上层血清，肝组、肱四头肌经生理盐水处理后捣碎处理成10%组织匀浆。肝糖原(LG)、肌糖原(LA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、丙二醛(MDA)含量严格按照试剂盒操作说明测定，剩余样本保存于-70 ℃超低温冰箱中备用。

1.8 统计

应用SPSS 19.0软件对数据进行。实验数据以均值±标准偏差(Mean±SD)表示，多样本均数间比较采用One-way ANOVA检验，各组间多重比较采用LSD法，P≤0.05为差异有显著性。采用Origin 2017软件进行图表处理及图谱分析处理。

2 结果与分析

2.1 硒元素分析

经微量凯氏定氮法计算，粉碎富硒大豆粉的蛋白质质量分数约为46.73%，富硒大豆蛋白的蛋白质质量分数为88.32%。实验通过HPLC-ICP-MS法对大豆分离蛋白以及低聚肽中元素硒含量进行了测定，其中富硒大豆分离蛋白中硒元素含量为(76.39±1.09) μg/kg，大豆低聚肽的中元素硒含量为(90.03±3.23) μg/kg，主要形态硒为硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸。富硒大豆低聚肽总硒元素含量高于富硒大豆分离蛋白，可能是由于分子质量为3 ku的富硒大豆低聚肽中所包含硒蛋白序列更多。 Khanam[13]研究发现硒代蛋氨酸和硒代半胱氨酸是谷物和豆类中硒的主要存在形式，与本实验结果相符。

图1 ICP-MS色谱图

2.2 负重力竭游泳实验

小鼠负重游泳力竭时间的长短是评价受试样品抗疲劳能力的最直接指标[14]。各组小鼠收拾前后体重的变化及小鼠负重游泳力竭时间见表1，可以发现各组小鼠的体重在试验前后并未出现显著差异(P>0.05)，但在第三周模型组有个别小鼠死亡，但总样本数大于8只，具有统计学意义。与对照组相比模型组的负重游泳时长显著降低(P<0.05)，说明模型组出现了运动性疲劳症状；富硒大豆低聚肽低/高剂量组以及大豆低聚肽组低/高剂量与模型组相比负重游泳时间显著延长(P<0.05)，表明富硒大豆低聚肽与大豆低聚都具有一定的抗运动性疲劳能力，富硒大豆低聚肽低剂量组与大豆低聚肽组高剂量负重游泳时间无显著差异(P>0.05)，富硒大豆低聚肽高剂量组效果最佳，负重游泳时长约提高了48.22%，表明富硒大豆低聚肽在高剂浓度下具有良好的抗运动性疲劳能力。

表1 小鼠体重变化及负重游泳时间

2.3 小鼠体内生化指标

机体在运动过程中，为了满足机体能量代谢的需求氧化代谢强度必然大大增加，这就导致机体内的活性氧自由基的必然增加，由于测量血液和组织中自由基水平比较困难，而检测血液和组织中抗氧化酶则相对简单，以此来间接反映机体内自由基蓄积水平，从而判断机体疲劳程度。

2.3.1 超氧化物歧化酶

超氧化物歧化酶是氧自由基的唯一底酶，它广泛存在于体细胞中，能过通过歧化反应将活性氧自由基转化成毒性相对较低的H2O2，从而起到基保护细胞膜系统结构与功能完整性的作用[15]。在本实验中，模型组中超氧化物歧化酶的活性显著低于对照组(P<0.05)，从统计结果发现大豆低聚肽低剂量组SOD活性虽高于模型组但差异不显著(P>0.05),富硒大豆低聚肽低剂量组与大豆低聚肽低剂量组无显著差异(P>0.05)，但显著高于模型组(P<0.05)，富硒大豆低聚肽高剂量组与大豆低聚肽高剂量组显著高于模型组(P<0.05)，分别提高了28.42%、12.78%。

2.3.2 谷胱甘肽过氧化物酶

谷胱甘肽过氧化物酶以谷胱甘肽为底物，其主要抗氧化机制是将体内的H2O2高效还原成H2O，从而免受组织和细胞免受氧化损伤[16]。在本实验中，模型组中谷胱甘肽过氧化物酶的活性显著低于对照组(P<0.05)，富硒大豆低聚肽低剂量组与大豆低聚肽低剂量组与模型组相比未能显著提高GSH-Px酶活性(P>0.05)，与大豆低聚肽高剂量组也无显著差异(P>0.05)，但富硒大豆低聚肽高剂量组和大豆低聚肽高剂量组与模型组相比分别提高了23.85%和10.70%，具有统计学差异(P<0.05)。富硒大豆低聚肽中的硒代半胱氨酸能够作为GSH-Px的活性中心，使GSH-Px活性的提高。此外，人体组织不能合成硒代蛋氨酸[17]，Navarro等[18]也发现硒代蛋氨酸也具有较好恢复GSH-Px活性的作用。

2.3.3 丙二醛

丙二醛的过量堆积会致使组织与细胞的过氧化损伤，它是一种由机体过剩自由基导致的不饱和脂肪酸形成的脂质过氧化物，可用以评估自由基所引起的脂质过氧化程度[19]。模型组小鼠血清中丙二醛的含量显著高于对照组(P<0.05)，四组剂量组均能使小鼠血清中丙二醛的含量显著低于模型组(P<0.05)，其中富硒低聚肽高剂量组MDA含量最低，脂质抗过氧化能力最强，约降低了23.43%，表明富硒低聚肽在高剂量组下抗运动性疲劳效果良好。

表2 小鼠血清生化指标

2.3.4 肌糖原与肝糖原的变化

研究表明由运动所导致的体力耗尽与肌糖原的消耗同步进行，而为了维持运动状态所需的血糖水平会逐渐消耗肝糖原，使肝糖原含量降低[20]。肌糖原与肝糖原的变化结果见表3，通过对照组与模型组小鼠运动后肝糖原和肌糖原含量可以发现，LA与LG的数据结果相似，运动性疲劳会导致小鼠肝糖原与肌糖原含量显著降低(P<0.05)，四组剂量组均能够使小鼠的肝糖原与肌糖原含量升高，但两组低剂量组未能使LG和LA含量与模型组产生显著性差异(P>0.05)，富硒低聚肽高剂量组LG和LA含量显著高于其余三组剂量组。

表3 小鼠肌糖原及肝糖原

3 结论

实验采用了超滤辅助双酶酶解法制备了富硒大豆低聚肽，并在运动性疲劳小鼠模型下，采用负重力竭游泳实验以及相关生化指标对四组剂量组的抗疲劳效果进行评估。其中富硒大豆低聚肽高剂量组力竭游泳时间最长约为(37.47±1.33)min，小鼠体内血液生化指标的结果总体显示该剂量组具有最佳的抗氧化活性，这主要是由于摄入的硒元素能够参与体内抗氧化酶的合成，提高了抗氧化物酶的酶活，从而延缓了由于脂质过氧化而产生的疲劳；肌糖原与肝糖原的含量表明该剂量组能使小鼠具有更高的糖原储备，因而可以通过消耗更多糖原提供能量，从而提高了小鼠的抗疲劳能力。