广东省广州市猪禽屠宰场环境沙门氏菌血清分型与耐药性分析

林本夫，潘婧淇，梁梦诗，丘穗萍，袁晓琪，王梦华，原丽红

（1.广州市花都区动物卫生监督所，广东广州 510800；2.广东药科大学生命科学与生物制药学院，广东广州 510006；3.仲恺农业工程学院，广东广州 510000）

食源性疾病是当前世界上最突出的公共卫生问题，全球每年约有1/3 的人群患食源性疾病[1]，其中220 万人死亡，主要为儿童[2]。我国每年有2～3 亿人次（即1/6 左右人口）患食源性疾病[3]。沙门氏菌是一类常见且危害较大的食源性致病菌，可通过环境污染食物而引发人类疾病。全球沙门氏菌监测网（WHO GSS）数据显示，全球每年有1亿多人感染沙门氏菌，死亡超过15 万人。我国大陆地区70%～80%的细菌性食物中毒由沙门氏菌引起，其中超过90%以家养畜禽、畜禽肉、禽蛋及其制品为传播基质，而肉制品沙门氏菌污染往往由屠宰、加工过程中的污染所致[4-7]。

广东是猪禽养殖和消费大省，也是食源性沙门氏菌病高发地区[8]。2018 年广东省生猪出栏3 757.4 万头，猪肉供应量282 万t；2019 年全省生猪产能受非洲猪瘟及环保限养影响而大幅下降，但出栏总量和猪肉供应量仍保持较高水平，分别为2 940.2 万头和221.9 万t[9]。2019 年广东省家禽年出栏量达12.12 亿只，禽肉年产量176.24 万t[10]。前期研究（待发表），系统分析了广州市禽类养殖、屠宰和销售3 大环节沙门氏菌污染情况，以及各环节内动物-环境-职业人群3 大要素对沙门氏菌传播扩散的影响，发现屠宰环节沙门氏菌污染最严重（18.82%），其中环境污染是导致沙门氏菌传播扩散的主要因素。本研究对广州市大型猪禽屠宰场环境进行监控，通过检测场内的空气、土壤、污泥、暂养舍、屠宰车间、运输车等拭子样品中沙门氏菌分布情况，评估场内沙门氏菌污染主要因素，通过血清型分析和药敏试验，对比分析广州市猪禽屠宰场沙门氏菌的主要血清型和耐药谱，旨在为基层沙门氏菌病防控，降低沙门氏菌污染导致食源性疾病的发生提供依据。

1 材料与方法

1.1 试剂

缓冲蛋白胨水（BPW）、四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液、亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液、沙门氏菌显色培养基（CRM004）、亚硫酸铋（BS）琼脂、MHA 干粉，购自广东环凯微生物技术有限公司；引物，由生工生物科技（上海）有限公司合成；1.1×T3 Super PCR Mix、TS-GelRed 核酸凝胶染料、DL 2 000 DNA Marker、DL 5 000 DNA Marker、琼脂粉，购自北京擎科生物科技有限公司；PCR 产物回收试剂盒，购自TaKaRa 生物工程有限公司。沙门氏菌诊断血清，购自泰国S&A 公司；12 种抗生素药敏片（直径6 mm），购自杭州微生物试剂有限公司，包括庆大霉素（GEN）、诺氟沙星（NFX）、氟苯尼考（FFC）、环丙沙星（CIP）、阿莫西林（AMX）、头孢噻吩（CEF）、头孢噻肟（CTX）、氨苄西林（AMP）、头孢曲松（CRO）、头孢他啶（CAZ）、氨曲南（ATM）、亚胺培南（IPM）。

1.2 样品采集

2019 年5 月，在广州市某区的2 个大型生猪屠宰场和3 个禽类屠宰场采集环境样品268 份，包括空气、土壤、污泥样品，以及其他环境拭子样品（如运输车辆、待宰圈/舍、屠宰车间等）。采集方法如下：（1）空气样品。分别在屠宰车间、待宰圈/舍、办公室3 个采样点通风处约1.5 m 高处架设SKC空气采样器，0.5% BSA/PBS 缓冲液以8 mL/h 流速，110 V采样12 h/d，记为1份空气样品，连续采集3 d。（2）土壤样品。分别在猪禽屠宰场入口、屠宰车间、待宰圈舍等空间，按梅花形采样法采集土壤样品，5～10 g/份。（3）污泥样品。在排污池四角处分别采集池内污水约10 mL/份。（4）环境拭子样品。用无菌棉拭子分别在屠宰车间、待宰圈/舍以及猪禽运输车辆采集环境样品，每个空间或车辆采集5份拭子样品，分别放入无菌0.5% BSA/PBS 缓冲液中保存。所有样品采集后于4 ℃保存，用冰盒低温运回实验室后立即进行沙门氏菌分离培养。

1.3 样品池准备

为分析不同空间（屠宰、待宰、办公）、不同类型（空气、土壤、污泥等）样品沙门氏菌污染情况，将同一空间内采集的同一类型样品合并，制备样品池用于沙门氏菌检测：（1）将每个采样点连续3 d 采集的空气样品合并，记为1 个样品池；（2）将每个空间采集的土壤样品合并为1 个样品池；（3）将每个排污池采集的污泥样品合并为1个样品池；（4）将每个空间或车辆采集的环境拭子合并为1 个样品池。

1.4 沙门氏菌分离验证

根据国标GB 4789.4—2016，将每个样品池样品接种于15 mL 缓冲蛋白胨水BPW，于37 ℃180 r/min 过夜，进行预增菌；各取1 mL 预增菌样品分别转种于10 mL TTB（42 ℃，18～24 h）和10 mL SC（37 ℃，18～24 h）进行增菌；增菌后，用接种环分别取TTB 增菌液和SC 增菌液划线接种于沙门氏菌显色培养基（CRM004）平板，每个样品重复划线接种3 次，于37 ℃培养过夜；对TTB、SC双阳性样品，挑取品红（紫）色单菌落划线接种于BS 培养板进行复筛，于37 ℃培养过夜；挑取棕色/墨绿色/黑色有金属光泽的单菌落接种于10 mL LB 培养基中，37 ℃培养过夜，用于PCR 扩增测序。

利用沙门氏菌特异引物（InvA-F：gtgaaattatcgccacgttcgggcaa/InvA-R：tcatcgcaccgtcaaaggaacc）[11]，对疑似阳性菌落进行扩增鉴定，扩增产物（约284 bp 条带）送生工生物科技（上海）有限公司进行测序鉴定。PCR 体系扩增条件：95 ℃预变性 5 min；95 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35 个循环；最后72 ℃延伸10 min。

1.5 沙门氏菌血清分型

根据国标GB 4789.4—2016 和沙门氏菌诊断血清产品说明书，对PCR 鉴定阳性的沙门氏菌菌株进行血清型鉴定：首先用O 多价血清进行凝集反应，如果菌株与O 多价血清发生凝集，则继续使用O 多价血清中包含的相应群血清进行测定；如果菌株与某一O 群血清发生凝集，则继续使用该群包含的单因子抗血清进行测试。确定O 抗原血清型后，依次用H 多价抗血清测定H 血清型。

1.6 沙门氏菌药敏分析

根据行标WS/T 639—2018，取过夜培养的沙门氏菌菌液（约1.5×108CFU/mL）均匀涂布于MHA 琼脂平板（内径14 cm，厚度3～4 mm）；待菌液干燥后用无菌镊子将药敏片（6 mm）紧密贴于培养基上，各药敏片中心相距2.5 cm 以上；平皿于37 ℃继续培养24 h 后，使用游标卡尺测量无明显细菌生长区域的直径（含药敏片），根据药敏片说明书提供的参考数值判定抑菌情况。

2 结果

2.1 样品采集与沙门氏菌分离

从生猪屠宰场和禽类屠宰场共采集空气、土壤等各类环境样品268 份，组成各类样品池55 个。通过国标GB 4789.4—2016 对样品进行沙门氏菌分离培养，结合PCR 扩增和测序，共获得10 个沙门氏菌阳性样品池（生猪屠宰场7 个、禽类屠宰场3个），总检出率为18.18%（表1）。独立样本卡方分析显示，猪禽屠宰场之间沙门氏菌污染率无显著差异（P＞0.05），而不同类型样品之间沙门氏菌污染率差异显著（P＜0.05），其中排污池污泥样品污染最严重（75.00%），土壤和屠宰车间次之。

2.2 沙门氏菌血清分型

通过沙门氏菌O/H 多价和单因子血清分型鉴定，10 株沙门氏菌共鉴定到5 种血清型，包括鼠伤寒沙门氏菌（S.typhimurium，n=5）、肠炎沙门氏菌（S.enteritidis，n=2）、德尔卑沙门氏菌（S.derby，n=2）和蒙得维的亚沙门氏菌（S.montevideo，n=1）。其中：分离自猪屠宰场的7 株沙门氏菌中，有5 株鼠伤寒沙门氏菌、1 株德尔卑沙门氏菌、1 株蒙得维的亚沙门氏菌；来自禽屠宰场的3 株沙门氏菌中，有2 株肠炎沙门氏菌、1 株为德尔卑沙门氏菌。详见表2。

2.3 药敏分析

本研究选择12 种临床常用抗生素根据行标WS/T 639—2018，对10 株猪禽屠宰场分离到的沙门氏菌进行药敏分析。结果显示：10 株沙门氏菌对阿莫西林和氨苄西林两种抗生素完全抗药，对亚胺培南完全敏感；猪屠宰场分离到的7 株沙门氏菌与禽屠宰场分离的3 株沙门氏菌对抗生素敏感的种类相似（表3）。

表1 环境样本沙门氏菌检测结果统计

表2 沙门氏菌血清型鉴定

3 种来自猪屠宰场的沙门氏菌血清型至少对2种以上抗生素产生抗药性，其中3 株鼠伤寒沙门氏菌对3 种或4 种抗生素产生抗药性，而德尔卑沙门氏菌对4 种抗生素同时耐药。此外，两种来自禽屠宰场的沙门氏菌血清型也均对2 种及以上抗生素产生抗药，其中德尔卑沙门氏菌对5 种抗生素同时耐药（表4）。不同血清型沙门氏菌对庆大霉素、氟苯尼考、环丙沙星、阿莫西林、氨苄西林5 种抗生素的抗药情况严重，其中所有血清型对阿莫西林和氨苄西林完全抗药；猪屠宰场分离的1 株沙门氏菌对庆大霉素、氟苯尼考、阿莫西林、氨苄西林4 种抗生素完全抗药，禽屠宰场分离的1 株沙门氏菌对庆大霉素、氟苯尼考、环丙沙星、阿莫西林、氨苄西林5 种抗生素完全抗药（表4）。

表3 沙门氏菌抗生素耐药性分析结果

表4 沙门氏菌血清型与抗药性分析 %

3 讨论

沙门氏菌是一类广泛分布的食源性致病菌。人主要通过食入被其污染的食品而感染，一旦接触并摄入大量沙门氏菌（105～106个/g）就会引起细菌性感染，进而在毒素作用下发生食物中毒。被沙门氏菌污染的肉、蛋等制品是沙门氏菌病的主要传染源，而被沙门氏菌污染的环境（如土壤、笼舍、砧板等）是导致肉、蛋污染的主要因素[5]。因此，做好环境沙门氏菌污染的控制，可有效阻断沙门氏菌的传播途径，保障人类健康和经济发展。

张华宁等[6]和李薇薇等[7]分别对山东、四川两省的肉鸡孵化、养殖、屠宰、流通等环节沙门菌污染程度进行检测，发现屠宰环节沙门氏菌污染情况最严重，分别达到27.0% 和24.9%。赵格等[12]的研究数据显示，我国部分地区屠宰环节猪肉中沙门氏菌污染率达到32.9%。刘鲜鲜等[11]调查发现，山东省部分生猪屠宰场沙门氏菌污染率为12.0%～34.6%。本研究发现，广州市猪禽屠宰场沙门氏菌污染率分别为21.86%、13.04%，表明禽类屠宰场情况略好于生猪屠宰场，然而二者无显著差异；进一步分析表明，不同类型样品之间沙门氏菌污染情况差异显著，污泥、土壤、屠宰车间是屠宰场沙门氏菌污染、扩散的主要环节。因此，猪禽屠宰场沙门氏菌控制重点应放在污水、场区地面以及屠宰车间的消毒和处理。

李月华等[13]对我国部分地区猪、禽源沙门氏菌的血清型分析结果显示，鼠伤寒沙门氏菌（58.43%）和肠炎沙门氏菌（59.69%）分别为猪、禽沙门氏菌优势血清型。陈健皓[14]在对猪源、鸡源沙门氏菌的分子溯源中发现，猪源和鸡源沙门氏菌分别以德尔卑（10.48%）和肠炎（50.00%）沙门氏菌为主。岳秀英等[15]对四川省猪场拭子样品检测发现，德尔卑沙门氏菌（60.26%）为主要血清型，其次为鼠伤寒（16.56%）和里森（6.60%）沙门氏菌。刘鲜鲜等[11]对山东省部分生猪屠宰场屠宰环节进行沙门氏菌血清型鉴定发现，屠宰环节以德尔卑（39.60%）、鼠伤寒（27.72%）、汤卜逊（16.83%）等沙门氏菌为主，而其中鲁东、西部地区鼠伤寒沙门菌为优势型，东北部地区和西南部以德尔卑沙门氏菌为优势型，中部地区则是汤卜逊沙门氏菌。杨盛智等[16]对四川省鸡肉和鸡蛋生产加工中的沙门氏菌血清型鉴定发现，肠炎沙门氏菌（44.1%）为主要血清型，其次为德尔卑（19.5%）和鼠伤寒（9.7%）沙门氏菌；同时发现在不同生产链环节中，优势血清型也不一致，如养殖环节优势型为肠炎沙门氏菌，而鸡蛋生产过程中为德尔卑沙门氏菌。本研究结果显示，广州市猪禽屠宰场分离的沙门氏菌以鼠伤寒和肠炎沙门氏菌为主，其次为德尔卑沙门氏菌。近年来相关研究表明，鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌和德尔卑沙门氏菌在不同地区猪禽产业链的不同环节分布广泛，是食源性沙门氏菌主要致病菌，应进行针对性防控。

本研究从猪禽屠宰场分离到的10 株沙门氏菌，对阿莫西林、氨苄西林2 种抗生素完全抗药（耐药率100%），对亚胺培南完全敏感（高敏率100%），对头孢曲松、头孢他啶、头孢噻吩、氨曲南4 种抗生素高度敏感（高敏率＞57%），对诺氟沙星、氟苯尼考2 种抗生素较敏感；85.7%猪源和66.7%禽源沙门氏菌对2 种以上抗生素耐药，其中猪源德尔卑沙门氏菌对4 种抗生素耐药，禽源德尔卑沙门氏菌对5 种抗生素耐药。夏宇飞等[17]对湖南省的猪源与鸡源沙门氏菌抗药性分析结果显示，猪源和禽源沙门氏菌对四环素、氨苄西林、磺胺异恶唑具有很强的耐药性（＞62%），对阿莫西林/克拉维酸、氟苯尼考耐药率在40%左右，无菌株对乙酰甲喹、安普霉素耐药；多重耐药性分析结果显示，每株菌至少对1 种抗生素耐药，最高出现13 重耐药菌株。岳秀英等[15]的研究结果显示，猪养殖场沙门氏菌对氨苄西林、阿莫西林/克拉维酸、大观霉素、四环素、磺胺异噁唑、复方新诺明和恩诺沙星7 种药物的耐药率最高（＞86%），对头孢噻呋和多粘菌素E 相对敏感。张珍[18]对鸡沙门氏菌的毒力基因和致病性研究中发现，分离到的55 株沙门氏菌均对利福平、阿莫西林、青霉素G、苯唑西林以及头孢噻吩的耐药率达到100%，对红霉素、林可霉素、多粘菌素B、复方新诺明及呋喃妥因耐药率达到90%以上，对强力霉素、链霉素及诺氟沙星的耐药率为50%～90%，对庆大霉素及大观霉素较为敏感（耐药率＜10%）。崔苗苗等[19]研究发现，鸡肠炎沙门氏菌对头孢噻呋、恩诺沙星、氧氟沙星、沙拉沙星高度敏感。综合近年猪禽产业链沙门氏菌抗药性分析结果，发现沙门氏菌普遍对阿莫西林、氨苄西林这2 种抗生素高度耐药，表明这2 种抗生素不适合在基层用于沙门氏菌病治疗，而亚胺培南、头孢曲松、头孢他啶、头孢噻吩、氨曲南等抗生素仍保持较高的抑菌率，适合在基层使用。

本研究对广州市大型猪禽屠宰企业环境进行沙门氏菌监控，发现猪禽屠宰场沙门氏菌污染情况较为严重，污泥、土壤、屠宰车间是沙门氏菌污染扩散的主要环节，应作为日常消毒的重点。此外，屠宰场分离的沙门氏菌优势血清型为鼠伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌，所有菌株对阿莫西林、氨苄西林2 种抗生素完全抗药，但对亚胺培南、头孢曲松、头孢他啶、头孢噻吩、氨曲南5 种抗生素高度敏感，因此基层可选用上述高度敏感的5 类抗生素作为沙门氏菌病的治疗用药。