新疆伊犁州首起牛结节性皮肤病疫情的诊断及处置

马晓艳，王 文，苏晓慧，薛 文，陈卫东，翟少华，陈荣贵，王永生，夏 俊，秦 菊，努尔麦麦提·阿穆提

（1.新疆维吾尔自治区动物疾病预防控制中心，新疆乌鲁木齐 830011；2.新疆农业大学动物医学学院，新疆乌鲁木齐 830052；3.伊犁州动物疾病控制与诊断中心，新疆伊宁 835000；4.新疆畜牧科学院兽医研究所，动物临床医学研究中心，新疆乌鲁木齐 830011）

牛结节性皮肤病（lumpy skin disease，LSD）又称牛疙瘩皮肤病、牛结节疹，是由牛结节性皮肤病病毒（lumpy skin disease virus，LSDV）引起的牛的一种急性、亚急性或慢性传染病。世界动物卫生组织（OIE）将其列为须通报动物疫病，我国在《中华人民共和国进境动物检疫疫病名录》中将其列为一类传染病[1]。患病牛是该病的主要传染源，病毒存在于病牛的皮肤结节、肌肉、血液、内脏、唾液、鼻腔分泌物及精液中。病牛恢复后常带毒3 周以上。LSDV 还可以通过蚊子、苍蝇等节肢动物机械性传播，也可通过饮水、饲料或直接接触而传播，在蚊虫活跃时期由其引起的发病概率会明显增高[2-3]。

2019 年8 月，新疆伊犁州察布查尔县、霍城县、伊宁市陆续有兽医报告发现，多个场点的牛皮肤、乳头、睾丸、鼻腔、口腔等部位长有大小不等的疙瘩。临床排查发现，累计3 个县（市）的17个乡镇发生上述情况。初步临床诊断后，采集特征性病变的牛皮肤结节及病死牛组织脏器开展实验室检测，并将样品及时送至中国动物卫生与流行病学中心国家外来动物疫病研究中心诊断，最终确定病原为LSDV。截至8 月13 日，伊犁州畜牧兽医部门累计排查活牛67.14 万头。共有504 头牛相继发病，并伴有持续高烧，其中死亡1 头，发病率为17.83%（1/2 826），病死率为0.20%（1/504）。发病牛以母牛居多，不同年龄的牛均有发病，怀孕病牛未见流产情况。

这是我国首起LSD 疫情，本文介绍了该疫情的诊断及处置情况，以期为LSD 防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要仪器设备

高速八维旋转组织研磨仪，购自德国Bertin公司；核酸提取仪NP968，购自西安天隆有限责任公司；荧光PCR 仪QuantStudio 5，购自ABI 公司；离心机，购自Sigma 公司；生物安全柜，购自上海力申科学仪器有限公司；冰冻切片机，购自莱卡公司；超薄切片机，购自LKB 公司。

1.2 主要试剂

LSDV 特异性引物、荧光标记探针、阳性/阴性对照，由中国动物卫生与流行病学中心提供；DNA 病毒荧光PCR 反应液（生产批号YDNA20190401），购自哈尔滨世纪元亨公司；羊痘/牛结节性皮肤病双抗原夹心ELISA 试剂盒（生产批号E83），购自法国IDVET 公司。

1.3 样品采集

采集3 头发病牛样品共58 份，包括皮肤、睾丸、乳头等部位结节和病死牛肺脏、脾脏、肾脏、淋巴结等脏器的12 份病原样品以及46 份血清样品。对采集的样品开展实验室检测，同时送至国家外来动物疫病研究中心检测。

此外，LSD 疫情解封时，按照30%的比例全覆盖抽样，采集牛全血样本833 份及蚊虫样品5 袋。其中察布查尔县共有15 个乡镇和1 个牧业公司，阳性同群牛2 635 头，另采集其中2 个乡镇的蚊虫5 袋；伊宁市3 个乡镇，阳性同群牛144 头；霍城县2 个乡镇，阳性同群牛47 头。3 个疫区共采样743 份抗凝血；同时3 个受威胁区的规模场及散养户进行同样数量的抽样监测，昭苏县采集1 个乡镇4 个村，巩留县1 个乡镇5 个村，特克斯县采集2个乡镇，3 个受威胁区各采集30 份抗凝血共90 份。

1.4 组织病理学检查

切取一块2.0 cm×2.0 cm×0.3 cm 大小，并经病原学检测为阳性的样品，以10%甲醛和95%乙醇固定，经各种浓度乙醇脱水2 h；二甲苯透明处理，将透明好的组织块放入石蜡中包埋；修整蜡块后切片，将切好的组织蜡片用眼科镊平铺在40～45 ℃的水面上；用载玻片捞取后，倾去余水，再置入60～65 ℃恒温箱内烤片，最后进行HE 染色和封片。

1.5 血清学检测

通过检测牛血清中LSD 病毒抗体来判定是否感染。根据羊痘/牛结节性皮肤病双抗原夹心ELISA 试剂盒的规程进行操作，检测牛血清中LSD 病毒抗体，共检测牛血清46 份。

1.6 病原学诊断

将采集的发病牛皮肤以及睾丸、乳头、鼻腔等部位结节以及病死牛肺脏、脾脏、肾脏、淋巴结等脏器的12 份样品，在生物安全柜中进行处理、研磨；用磁珠法在核酸提取仪中提取病毒DNA，荧光PCR 方法进行扩增。具体方法：在生物安全柜中处理、研磨后，将研磨液离心吸取上清，提取DNA，使用中国动物卫生与流行病学中心提供的LSDV 荧光探针、引物，以及商品化的DNA 病毒荧光PCR 反应液，根据聂福平等[4]建立的LSDVTaqMan-MGB 荧光定量PCR 方法对提取的DNA开展荧光PCR 扩增。

LSD 疫情解封时，对采集的833 份牛全血样本及蚊虫样品同样按照上述方法进行检测。

2 结果

2.1 临床症状

在伊犁州察布查尔县、霍城县的疫点可观察到：患病牛精神倦怠、消瘦、体温升高；皮肤出现非常坚硬的丘疹或圆形凸起的结节，用手触碰病牛结节，病牛疼痛难忍；除全身皮肤结节外，在母牛会阴、乳头部位，公牛睾丸部位，鼻腔内部、嘴唇周边都能看到大小不等的结节（图1～3）。结节直径约1～7 cm，厚度约1～3 cm。

2.2 剖检病理变化

图1 牛腹部两侧皮肤表面结节[5]

图2 牛大腿外侧皮肤结节[5]

图3 牛乳房表面结节

剖检病死牛发现，长疙瘩处的脏器皮内肿胀，心肌条状、点状出血，肝脏、脾脏出血，胆囊胀大充盈、出血，脾脏质地变硬，真胃黏膜出血，小肠、大肠黏膜点状出血，肠系膜淋巴结出血，颌下淋巴结肿大，肺脏出血。观察现场采集的发病牛皮肤结节样品发现，皮肤肿胀部位有明显凸起，皮肤结节内侧出血，并有胶冻样病变（图4～5）。通过临床症状和剖检病理变化，初步判定为疑似LSD。

图4 牛结节性皮肤块外侧

图5 牛结节性皮肤块内侧

2.3 皮肤结节病理切片观察

在显微镜下观察皮肤结节病理切片发现，肌肉间结缔组织出现增生性结节，结节内可见成纤维细胞和胶原组织，结节周围有结缔组织包囊形成及结节周围有淋巴细胞浸润（图6）。此外，还可观察到表皮毛囊周围组织间隙淋巴细胞浸润，毛囊腺体肿胀、空泡化，真皮层肌肉组织坏死，且坏死区大量淋巴细胞浸润（图7）。

2.4 血清学检测

用羊痘/牛结节性皮肤病双抗原夹心ELISA试剂盒，对46 份发病牛血清进行LSDV 抗体检测。结果显示，16 份样品LSDV 抗体阳性，阳性检出率为34.78%。

图6 病变组织病理横切片

图7 病变组织病理纵切片

2.5 病原学检测

2.5.1 发病牛结节样品荧光PCR 检测 对采集的12 份病原样品（皮肤、睾丸、鼻腔、乳头结节以及剖检病死牛的肺脏、淋巴结等脏器）进行荧光PCR 扩增。结果（图8）显示，所有样品均为LSDV 核酸阳性。经国家外来动物疫病研究中心确诊，伊犁州察布查尔县的部分牛感染LSDV。

图8 发病牛样品LSDV 荧光PCR 扩增结果

2.5.2 解封后所采集样品荧光PCR 检测 参照二类动物疫病防治技术规范要求，相关机构对疫区实施了为期42 d 的疫情封锁。解封时，在伊宁县、霍城县、察布查尔县选择疫点、疫区、受威胁区的乡镇、村，开展抽样监测，进行风险评估。通过实地察看，按照30%的比例全覆盖抽样，采集牛抗凝血及疫点周边活动的蚊虫样品共833 份。对上述样品开展LSDV 荧光PCR 检测，结果发现所有样品检测均呈阴性（图9）。

图9 解封样品LSDV 荧光PCR 检测结果

3 疫情处置

3.1 严格处置确诊疫情，控制疫情扩散

一是扑杀阳性同群牛，限制同群牛移动（出牧场或出户），禁止疫情县活牛调出，禁止发病区域牛进出和流通，疫情发生前1 个月内生产的牛皮需鞣制成皮革方可调出。二是对疫点、掩埋场点、运输车辆严格清洗消毒。每次装运前进行消毒，运后再次清洗消毒，用次氯酸钠，按照由里向外、自上而下、从前到后的顺序清除牛粪、饲料等污物，清洗后晾干，再喷雾消毒。三是定期开展流行病学调查，查明疫情来源和可能传播去向，并对出现疑似疫情的周边区域等相关场地进行持续排查，及时消除疫情隐患。现场查看养殖、防疫、无害化处理等相关记录，持续监测，形成流调报告，并提出相关防控指导意见和疫情处置措施。四是加强联防联控，重点排查与哈萨克斯坦交界的相关县市，要求牛只远离边界草场放牧，发现病畜及时上报、隔离、消毒，同时采取杀灭昆虫等措施，防止疫情进一步扩散。五是积极宣传。组织边境县各乡（镇）落实好宣传等工作，防止出现恐慌，影响社会稳定。

3.2 用山羊痘疫苗紧急免疫

为杜绝疫情再次发生和蔓延，采用国家批准的山羊痘疫苗（按山羊5 倍剂量）对病牛所在的县及其相邻县（市）全部牛只开展免疫，免疫程序按照农牧发〔2019〕26 号文件要求执行。在政策允许的前提下，将免疫区域扩大到与新疆相邻省份，以确保不发生新的LSD 疫情。伊犁州3 个市、县解除封锁时，于9 月下旬采样，采集牛样品、环境蚊虫，开展LSD 实时荧光PCR 检测[4]，发现所有采集样品包括蚊虫全部为阴性（图9）。后期还要做好LSD 专项监测与排查工作（尤其在每年4—10 月），可通过血清学（ELISA）和病原学（PCR）检测，重点对伊犁州及全疆其他县市调入调出的牛群开展监测，防止疫情再次发生。

4 讨论

为及时查明此次疫情的感染源，通过察看临床症状、剖检病理变化以及结合发病时间（7 月底至8 月上旬蚊虫肆虐期），初步判定该疫情为疑似LSD。随后采集发病牛的鼻腔、乳头等部位结节和发病牛血清，开展病原学、血清学检测。荧光PCR 检测病原样品发现LSDV 核酸阳性；羊痘/牛结节性皮肤病双抗原夹心ELISA 试剂盒检测发病牛血清，发现LSDV 抗体阳性。经国家外来动物疫病研究中心检测，送检的疑似病料确诊为LSDV核酸阳性，这是我国首次确诊发现LSD 病例。

在LSD 流行的非洲等国家，该病的检测技术主要有病原分离鉴定、常规血清学检测和分子生物学检测[6]。本文利用灵敏度高、特异性强的荧光PCR 方法开展LSDV 分子生物学检测，利用双抗原夹心ELISA 开展发病初期血清学检测，结合临床症状、病理变化等辅助手段对LSD 进行快速诊断，并在疫情确诊后对疫区实施了封锁等一系列处置措施。在疫区解封后采集样品开展检测，发现所有样品均呈阴性，说明处置措施得当、有力，有效遏制了该病的传播，后期持续临床监测显示也没有新的疫情发生。此外，我国农业农村部制定并印发了《牛结节性皮肤病防治技术规范》《牛结节性皮肤病防控知识手册》等文件，今后也须尽快制定其他LSD 相关国家或行业标准，为检测、防控、消除LSD 做好技术支撑。