基于非洲猪瘟病毒标准物质的荧光PCR 检测试剂盒初步评价

（宁夏动物疾病预防控制中心，宁夏银川 750001）

非洲猪瘟（African swine fever，ASF）是由非洲猪瘟病毒（African Swine fever virus，ASFV）引起家猪和野猪的一种急性、热性、高度接触性传染病，发病过程短，死亡率可高达100%，对养猪业危害极大。因此，世界动物卫生组织（OIE）将其列为须通报动物疫病，我国将其列为重点防范的一类动物疫病[1]。

目前，ASFV 的实验室检测方法主要有PCR、荧光PCR、ELISA 等。相较于ELISA 方法，荧光PCR 方法在猪感染早期即可检测到ASFV 核酸，具有快速、准确、敏感性高等优点，是监测和早期诊断ASF 的重要手段，同时用荧光PCR 方法检测ASFV 也是OIE 认可的方法。

2018 年8 月3 日我国首例ASF 疫情被确诊以来，各种ASFV 检测试剂盒在我国ASF 防控中发挥了重要作用，但同时如何选用最合适的试剂盒开展防控工作，成为各兽医实验室面临的一项重要工作。为探究ASFV 标准物质作为试剂盒评价体系的可行性，本研究使用ASFVP72基因核酸标准物质作为评价标准，对市场上5 种主流品牌ASFV荧光PCR 检测试剂盒的检测性能进行对比分析，以期为各实验室的ASFV 荧光PCR 检测试剂盒选择提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

ASFVP72基因核酸标准物质（质粒浓度5.9×103拷贝/μL），由中国动物疫病预防控制中心提供。5 个厂家（A、B、C、D、E，均为国产）生产的ASFV 荧光PCR 检测试剂盒信息见表1。无菌无核酶水，购自Promega 公司；一次性移液器吸头，购自Axygen 公司。

表1 5 个厂家生产的ASFV 荧光PCR 检测试剂盒信息

1.2 仪器和设备

单道微量移液器和多道微量移液器，购自Eppendorf 公司；iQ5 荧光定量PCR 仪，购自美国Bio-Rad 公司。

1.3 方法

将ASFVP72基因质粒标准物质进行10 倍倍比稀释（5.9×103～5.9×10-5拷贝/μL），设置3 个平行对照，使用5 个厂家的ASFV 检测试剂盒，严格按照试剂盒使用说明书，对不同浓度倍比稀释的标准物质进行检测，比较不同试剂盒之间的反应时长，并通过制作标准曲线分析不同试剂盒的敏感性和重复性。

2 结果

2.1 对照检测情况

本研究中，各厂家试剂盒自带的阴、阳性对照反应结果均判定为试验结果成立，表明该试剂盒的检测结果符合产品说明书要求。

2.2 反应时长比较

各试剂盒的实际反应耗时均高于理论反应耗时，其中D 厂家试剂盒差异最大，C 厂家试剂盒差异最小。B 厂家试剂盒理论反应耗时和实际反应耗时最短，A 厂家理论与实际反应耗时均最长。比较结果见表2。

表2 5 种厂家ASFV 荧光PCR 检测试剂盒反应时长比较

2.3 扩增曲线及标准曲线分析

各厂家试剂盒扩增曲线均具有明显的对数增长期，最低检测限均为5.9×10-1拷贝/μL，A、B、C、D 厂家试剂盒的线性关系R2＞0.98，其中C 试剂盒最优（R2=0.994）。5 个厂家的ASFV 检测试剂盒扩增曲线及标准曲线见图1～5。

3 分析与讨论

ASF 发病率、死亡率高，对养猪业危害极大。ASFV 抵抗力顽强，在组织中可保持长时间感染，并且目前无有效的ASF 疫苗和治疗方法[2]。ASF最重要的防控措施是监测、早期诊断并及时消灭传染源，而各种实验室检测方法为监测和及时诊断疫情提供了重要依据[3]。

图1 A 试剂扩增曲线及检测标准曲线

图2 B 试剂扩增曲线及检测标准曲线

图3 C 试剂扩增曲线及检测标准曲线

图4 D 试剂扩增曲线及检测标准曲线

图5 E 试剂扩增曲线及检测标准曲线

本试验使用ASFV 标准物质作为评价体系，对在售的5 个厂家生产的商品化AFSV 荧光PCR检测试剂盒进行了对比，结果表明5 个试剂盒都有良好的重复性，可用于ASFV 核酸检测。试验中，C 试剂盒检出Ct 值较其他试剂盒提前1.03 个循环且离散度小，所需反应时间亦较少。如果检测样品来源于病死生猪，并且有较高的病毒含量，那么5种试剂盒检测结果均无太大差异；若是无临床症状生猪或病毒含量低的样本，可以综合考虑选择离散度小、所需反应时间少的试剂盒。

标准物质作为一种“量具”，具有实验室校准、计量溯源性建立、其他材料赋值、测量方法/程序确认、实验室内或实验室间质量控制等用途[4]。已有研究认为，使用ASFV 核酸标准物质对不同ASFV 核酸检测试剂盒进行验证评价是一种有效的实验室内部质量控制手段。乔彩霞等[5]体外合成了ASFVVP72全基因能力验证用质控样品，可有效评价各级兽医实验室的检测能力。原霖等[4]基于含P72基因核酸序列的质粒pUC19-P72 研发的ASFV 标准物质具有均一性良好、量值准确度高、产品质量稳定、与动物样本互通性良好等优点。

本试验结果也表明，各生产厂家使用P72基因作为靶基因研制的ASFV 荧光PCR 检测试剂盒可使用ASFV 标准物质作为评价体系，来评判ASFV 核酸检测试剂盒的反应时间、灵敏度、可重复性等性能。