非洲猪瘟病毒核酸定性检测方法比对

王 晶，孙金红，薛晓晶

（1.中检科（北京）测试技术有限公司，北京 100123；2.中国检验检疫科学研究院综合检测中心，北京 100123）

非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）是非洲猪瘟病毒科、非洲猪瘟病毒属的唯一成员[1]，对家猪和野猪具有高度传染性和致死性[2]，可引发非洲猪瘟（African swine fever，ASF）疫情。ASFV 是双股线状DNA 病毒，呈复杂的正二十面体结构，可在低温、高湿环境下长期生存，能适应pH3～11 的宽泛酸碱环境[3-4]。ASFV粒子基因组大、易变异，编码蛋白种类多；病毒存活力强，能够通过多种方式和途径进行有效传播，潜伏期因传播方式而异，这是其在全球传播的重要原因之一[5]。

1921 年，肯尼亚报道了全球首例ASF 疫情，随后该病在多个国家和地区广泛流行[6-7]，2018 年8 月，我国出现首例ASF 疫情，尽管有关部门迅速采取扑杀等控制措施，然而疫情仍蔓延至全国，对我国养猪业造成严重经济损失[8-9]。由于ASFV的高致病性、传染性和致死性，世界动物卫生组织（OIE）将其列为须通报动物疫病，我国将其列为一类动物疫病[10]。ASFV 核酸检测是其防控工作的重要措施之一。自疫情发生以来，农业农村部先后发布了多项有关诊断试剂、病毒检测和实验室管理方面的政策[11-15]。

根据北京市农业农村局ASF 防控工作的有关要求，为确保北京市各ASF 实验室检测标准的一致性和结果的可靠性，2020 年7 月，本实验室参加了北京市动物疫病预防控制中心组织实施的ASF 实验室检测能力比对。参照SN/T 1559—2010标准[16]中的普通PCR 方法、荧光PCR 方法以及使用已取得农业农村部批准文号的试剂盒[15]，对血清样品开展检测比对，以期为兽医实验室ASFV核酸检测提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品、试剂

能力比对血清样品（5 个，编号分别为15、20、69、73、86），由北京市动物疫病预防控制中心提供；DNA 病毒基因组提取试剂盒、ASFV 荧光PCR 检测试剂盒，均购自青岛立见诊断技术发展中心；TaqMan PCR Master Mix、ExTaq聚合酶，均购自北京奥今东方科技有限公司；引物、探针和ASFV 核酸阳性质粒，由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。

1.2 仪器设备

Quant Studio 6 Flex 荧光定量PCR 仪、9700 PCR 仪，购自美国ABI 公司；INFINITY 3000 凝胶成像系统，购自法国Vilber 公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA 提取 参照DNA 病毒基因组提取试剂盒方法，提取样品DNA。

1.3.2 普通PCR 检测 使用SN/T 1559—2010 标准[16]中的引物进行PCR 扩增。引物序列见表1。每个反应管中包含50.00 μL 反应体系：1.25 mmol/L 的dNTP 8.00 μL，10×PCR Buffer 2.50 μL，TaqDNA聚合酶（5 U/μL）0.25 μL，终浓度0.40 pmol/L 的上下游引物各1.00 μL，DNA 模板5.00 μL，最后用双蒸水补齐至50.00 μL。PCR 反应条件为：94 ℃5 min；94 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，40个循环；最后72 ℃ 10 min。

1.3.3 荧光定量PCR 检测 使用SN/T 1559—2010 标准[16]中的引物和探针进行荧光定量PCR扩增。引物序列见表1。每个反应管中包含25.0 μL反应体系：2×TaqMan PCR Master Mix 12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，探针1.0 μL，DNA 模板5.0 μL，最后用双蒸水补齐至25.0 μL。荧光定量PCR 反应条件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；94 ℃ 15 s，58 ℃1 min，40 个循环。

表1 普通PCR 和荧光定量PCR 引物探针

1.3.4 ASFV 荧光PCR 试剂盒检测 使用商品化试剂盒中的引物探针进行荧光定量PCR 检测，反应体系和扩增条件均按说明书推荐操作进行。

1.3.5 检测过程质量控制 每个反应设置阳性、阴性及空白对照。其中SN/T 1559—2010 标准[16]中引物扩增的阳性对照使用对应序列合成的质粒DNA，阴性对照为不含目标基因的DNA，空白对照用无菌水代替。按标准和试剂盒说明书进行结果判定。

2 结果

2.1 普通PCR 检测

PCR 扩增、琼脂糖凝胶电泳检测结果（图1）显示：除阳性对照外，有4个样品（20、69、73、86 号）PCR 结果呈阳性，阳性样品与阳性对照一致，均扩增得到278 bp 的特异性条带，其中69 和73 号样品扩增强度较弱；15 号样品无扩增片段，检测结果为阴性。

图1 普通PCR 电泳图

2.2 荧光PCR 检测

荧光定量PCR 扩增结果（图2）显示，除阳性对照外，4 个样品荧光PCR 检测结果呈阳性，其中20、86 号样品扩增信号较强，Ct 值分别为22.8 和21.4；69、73 号样品扩增信号较弱，Ct 值分别为33.8和34.0。15号样品无扩增信号，无Ct值，结果判定为阴性。

图2 荧光PCR 扩增曲线

2.3 荧光PCR 商品试剂盒检测

根据试剂盒结果判定要求，阳性对照Ct ＜30 且出现特异性扩增曲线，阴性对照无Ct 值或Ct ≥40，说明检测结果有效。在此基础上，被检测样品Ct ＜40 且出现特异性扩增曲线，判定为阳性，结果与阴性对照一致的判定为阴性。检测结果（图3）显示，阳性、阴性和空白对照均符合质控要求。其中：20、86 号样品扩增信号较强，Ct 值分别为22.5 和22.9，判定为阳性；69、73 号样品扩增信号较弱，Ct 值分别为29.2 和29.4，判定为阳性；15 号样品无扩增信号，无Ct 值，判定为阴性。

图3 ASFV 荧光PCR 商品试剂盒检测结果

3 分析与讨论

ASFV 实验室检测是严防ASF 疫情发生的重要环节。ASFV 核酸检测的方法有普通PCR、实时荧光定量PCR、微滴数字PCR（ddPCR）、原位杂交（ISH）、环介导恒温扩增技术（LAMP）和重组酶扩增技术（RPA）等[17]。目前，ASFV 检测的主要依据有行业标准SN/T 1559—2010《非洲猪瘟检疫技术规范》[16]、国家标准GB/T 18648—2020《非洲猪瘟诊断技术》[18]以及OIETerrestrial Animal Health Code第2.8.1 章中ASFV 检测方法[19]。其中PCR 技术因具有快速、高效等优势成为主流检测手段。本次比对验证选择行业标准中的普通PCR、荧光定量PCR 和国家批准的商品化试剂盒（荧光定量PCR 方法）相互验证。比对发现，3 种方法结果一致，验证结果为“满意”。普通PCR 具备灵敏度高、成本低以及对样本纯度要求低等优点，适合没有荧光定量PCR 仪的基层实验室；但PCR 扩增产物需在开盖后进行琼脂糖凝胶电泳以观察特异性条带，开盖过程易造成交叉污染出现假阳性[20]。荧光定量PCR 特异性强、重复性好、自动化程度高并且不易污染样本和环境。商品化试剂盒将荧光定量PCR所需的试剂整合在一起，操作更加简便，检测结果一致性高，是ASFV 日常防控检测和实验室比对的指定方法[15]。

选用SN/T 1559—2010 标准方法[16]开展检测时，需获得阳性对照。为防止病毒污染，宜选用含有目标基因片段的阳性质粒。将标准中的引物序列在NCBI 网站上进行比对，发现该引物的序列信息为ASFV 结构蛋白基因p72，通过合成本段序列可获得阳性质粒[21]。因质粒DNA 的拷贝数很高，实验室在使用过程中要防止污染，应将质粒DNA 适当稀释后分装保存备用。选用商品化试剂盒检测时，要选用获得农业农村部批准文号的产品，以保证检测结果的合法性和可靠性。因相关政策法规实时更新，产品批准文号信息可在中国兽药信息网“兽药基础数据库”中随用随查。

比对验证是评价实验室技术能力的有效手段[22]。通过此次验证，进一步确认了实验室人员、仪器、方法以及环境各方面均需满足ASFV 检测要求。本次验证同时提高了检测机构的公信力，为及时发现和防控ASF 疫情提供了技术支撑。