安格斯犊牛腹泻的病理观察、病原分离鉴定和药敏试验及防治措施

林 清， 王永军， 王晶钰， 昝林森， 王继儒， 罗顺平， 王 菁， 马国锋， 蔡永红

(1.西北农林科技大学动物科技学院，陕西 杨凌 712100；2.宁夏西海固高端牛产业研究院，宁夏 海原 755220；3.海原华润农业有限公司，宁夏 海原 755220)

2019年10—11月份,宁夏自治区中卫市某牛场的安格斯犊牛发生了较为严重的腹泻症状。死亡率高达28%。犊牛腹泻是新生犊牛发生的一种急性腹泻病，引起犊牛腹泻的病因很多,包括细菌、病毒、寄生虫等病原微生物以及营养因素和环境因素等[1]。犊牛出生3周左右最容易发病[2]，但本次犊牛腹泻在产后3 d就出现相应症状。为有效应对犊牛腹泻,需进行实验室诊断,病原学诊断,提升准确性,降低犊牛死亡率[3]。为快速查明本次安格斯犊牛腹泻的原因，本文分别对发病死亡牛及时采样送检，进行病原分离、鉴定、药敏试验，并提出实际预防和治疗措施，以指导实际生产。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 病 牛 病牛来源于宁夏自治区中卫市某牛场，发病死亡牛6头，分别采集死亡1 h后的犊牛病变心脏、肺、肝及肠系膜淋巴结组织样，冰袋保存。

1.1.2 生化试剂 肉汤培养基、琼脂培养基参照文献[4]配制，4 ℃冰箱保存备用。革兰氏染色液来自实验室。

1.1.3 主要仪器 超净工作台(0066)，上海鸿都电子科技有限公司；自动恒温震荡培养箱(ZH-WY-2102C)，上海智诚分析仪器制造有限公司；隔水式恒温培养箱(GH-600BC)，北京永光明医疗器厂；4 ℃冰箱(BCD-209S/D)，海信容声冰箱有限公司；立式电热压力蒸汽灭菌锅(XFH-30CA)，浙江新丰医疗器械有限公司；台式高速离心机(H3-18KR)，湖南可成仪器设备有限公司；显微镜及实验室常用大小试管及培养皿等。

1.1.4 药敏试验 大观霉素(10 μg/片)，庆大霉素(10 μg/片)，青霉素(10 μg/片)，头孢曲松(10 μg/片)，氨苄西林(10 μg/片)，以上药敏纸片来自杭州天和微生物实际有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 病理观察 对发病犊牛症状、发病时间、发病特点、治疗效果进行诊断、处理和观察；对死亡犊牛在1 h内剖检，观察病变部位特征，并采集组织样。

1.2.2 组织样处理 取组织样100 mg研磨5 min，加生理盐水10 mL，离心10 min，取上清液涂片。

1.2.3 染色镜检 涂片革兰氏染色，镜检观察细菌染色及形态特征。

1.2.4 分离培养 将处理的组织样取上清液100 μL摇匀，接种于肉汤培养基中，37 ℃恒温振荡培养18～24 h后镜检，并将培养的细菌在琼脂培养基上划线培养，然后再继续37 ℃培养18～24 h，随后选择单个典型菌落染色镜检。

1.2.5 生化鉴定 参照文献[5]方法进行。

1.2.6 药敏试验 参照文献[6-8]方法进行，采用K-B纸片扩散法。

综合上述信息之后提出预防和治疗措施。

2 结果与分析

2.1 病理观察结果与分析

病例1：安格斯母犊HJ0348出生于2019年10月18日，妊娠天数261 d，体重29 kg。该犊牛于2019年10月28日开始出现拉稀症状，肌注加口服治疗后，于2019年11月1日出现食欲不振，脱水症状，体温36.8 ℃。静注头孢后，于2019年11月2日晚，治疗无效死亡。解剖发现：心脏基底部有明显的炎症斑点。死亡原因：心肌炎。具体结果以实验室检测结果为准。

病例2：安格斯母犊HJ0350出生于2019年10月19日，妊娠天数278 d，体重27 kg。该犊牛于2019年10月27日开始出现腹泻症状，肌注加口服治疗后，2019年10月31日出现精神不振，不食症状，体温：35.8 ℃。静注头孢治疗后于2019年11月3日无效死亡。解剖发现：肠系膜发炎，肠管发炎，心脏基底部有果冻样病变，肺脏苍白。死亡原因：肠炎继发心肌炎死亡。

以上发病均在产后10 d左右，与一般报道在3周内发病情况类似，但有提早发病的趋势。详情见图1～3。

图1 心肌病变图片

图2 肺组织病变图片

图3 肠系膜病变图片

2.2 病原分离培养及药敏试验结果与分析

实验室对不同组织的样品进行了处理，通过病原菌分离、培养、鉴定等过程，得出病原菌为志贺氏杆菌导致的犊牛腹泻病的结论，详见图4～6(未注明的是肺组织培养群落)。药敏试验结果如表1。

图4 肺部组织病原鉴定

图5 心脏组织病原鉴定

图6 不同组织病原菌培养群落

表1 犊牛腹泻病原的药敏试验

资料显示：志贺氏杆菌大小为(0.5～0.7) μm×(2～3) μm，无芽孢，无荚膜，无鞭毛，多数有菌毛，革兰氏阴性杆菌，直杆菌，形态似其他肠杆菌科的种。革兰氏阴性，不运动，兼性厌氧，具有呼吸和发酵两种类型的代谢。接触酶阳性(只有1个种例外)，氧化酶阴性，有机化能营养型，发酵糖类不产气(除了少数种产气外)，不利用柠檬酸盐或丙二酸盐作为惟一碳源，KCN中不生长，不产H2S。是动物的肠道致病菌，引起细菌性痢疾。以上特征与鉴定结果有较高切合度。

那么，志贺氏菌的致病机理有：菌毛能粘附于回肠末端和结肠粘膜的上皮细胞表面，继而在侵袭蛋白作用下穿入上皮细胞内，一般在粘膜固有层繁殖形成感染灶。此外，凡具有K抗原的痢疾杆菌，一般致病力较强；各型痢疾杆菌都具有强烈的内毒素，内毒素作用于肠壁，使其通透性增高，促进内毒素吸收，引起发热，神志障碍，甚至中毒性休克等。内毒素能破坏粘膜，形成炎症、溃汤，出现典型的脓血粘液便。内毒素还作用于肠壁植物神经系统，至肠功能紊乱、肠蠕动失调和痉挛，尤其直肠括约肌痉挛最为明显，出现腹痛、里急后重(频繁便意)等症状；志贺氏菌A群Ⅰ型及部分2型菌株还可产生外毒素，称志贺氏毒素，为蛋白质，不耐热，75～80 ℃环境下1 h被破坏。该毒素具有3种生物活性：①神经毒性，将毒素注射家兔或小鼠，作用于中枢神经系统，引起四肢麻痹、死亡；②细胞毒性，对肾细胞和HeLa细胞均有毒性；③肠毒性，具有类似大肠杆菌、霍乱弧菌肠毒素的活性，可以解释疾病早期出现的水样腹泻。以上情况与剖检结果基本一致。

2.3 紧急预防和治疗措施

2019年7—10月，针对犊牛发生流行性腹泻，虽全力救治，仍然发生100多头犊牛死亡或淘汰，造成巨大的经济损失。目前犊牛腹泻发病死亡率高，预防和治疗效果不明显。

经西北农林科技大学预防兽医学实验室对6头犊牛病料病原微生物分离检测和药敏实验，表明主要病原为志贺氏菌(痢疾杆菌)，筛选出3种敏感抗菌素用于防治，有一定效果。为此，详细分析了病情，在综合实验室试验结论的基础上提出当前及后续解决问题的措施。

2.3.1 临产牛 产前3 d肌肉注射敏感抗生素大观霉素。建议剂量40 mg/kg体重，每天2次。

2.3.2 产 房 产房严格消毒，垫草厚度不小于20 cm，接生地面铺设塑料布，严格杜绝犊牛出生后嘴与脏污物接触，犊牛初乳喂量不低于2.5 kg。

2.3.3 犊 牛 出生后3～5 d肌肉注射大观霉素。建议预防剂量20 mg/kg体重，每天1次；治疗剂量40 mg/kg体重，每天2次。

对于发生腹泻犊牛，治疗原则保证不脱水，不酸中毒；胃管投服口服补液盐，并保证能量(葡萄糖注射)。病情严重犊牛宜禁喂牛奶24 h。

2.3.4 犊牛饲喂方式 改变目前“母带犊”的犊牛饲喂方式。学习奶牛公司犊牛培育模式，收集初乳，经巴氏消毒后集中饲喂犊牛。必要时可以购买商品初乳，做好肉牛母牛挤奶保定架和挤奶、喂奶设备。