基于网络药理学研究小柴胡汤治疗肝癌的机制

钱晓涛，张媛媛

肝癌是中国第二大常见癌症，是致命的癌症之一。中国每年约有38.3万人死于肝癌，占全球肝癌死亡人数的51%，严重影响人们的健康甚至危及生命[1]。中医药在肝癌内科治疗方面有着确切的疗效,并且中医独特的理论体系和辨证论治原则可以使治疗更加个体化[2]。小柴胡汤由柴胡、黄芩、半夏、生姜、人参、大枣、甘草7味中药组成。其中柴胡、黄芩泄少阳郁热；半夏、生姜辛散，可顾护肠胃同时疏散气郁；人参、大枣益气扶正；甘草调中；全方具有和解少阳、调畅三焦气机的功效[3]。本文基于网络药理学研究方法，筛选小柴胡汤的主要活性成分及作用靶点，进一步根据网络拓扑分析筛选关键靶点，并进行GO富集分析和KEGG通路分析，有助于寻找治疗肝癌的新途径。

1 材料与方法

1.1 有效成分的筛选及靶点预测 检索中药系统药理学分析平台[4](TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php)，得到柴胡、黄芩、半夏、甘草、人参、生姜、大枣的有效成分及相关靶点，以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，类药性(drug likeness，DL)≥0.18为筛选条件。

1.2 靶标蛋白基因名的确定 使用Uniprot数据库[5]中的UniProKB检索功能(https://www.uniprot.org/)，查询靶标蛋白对应的基因名，并限定物种为“Homo sapiens”，将查询得到的靶点蛋白信息进行标准化。

1.3 肝癌的靶点筛选 以“liver cancer”为关键词，检索GeneCards数据库[6](https://genealacart.genecards.org/)和OMIM数据库[7](https://www.omim.org/)，得到疾病相关靶点。

1.4 小柴胡汤治疗肝癌的调控网络构建 将小柴胡汤和肝癌的靶点上传至在线作图工具Venny 2.1，绘制韦恩图(见图1)，得到中药药对活性成分与疾病的交集靶点，然后利用Cytoscape软件(V3.7.1)进行网络可视化，得到活性成分-交集靶点调控网络(见图2)。其中节点的类型有活性成分、靶点。

1.5 靶点蛋白互作网络(PPI)构建及关键靶点筛选 药物对疾病治疗的效应最终表现在蛋白相互作用上。运用韦恩图(Venn diagram)得到活性成分靶点与肝癌靶点的交集基因，导入STRING11.0(http://www.string-db.org/)，隐藏离散的网络节点，得到交集靶点的蛋白相互作用关系。

1.6 GO和KEGG富集分析 将1.4得到的活性成分与疾病的交集靶点利用R语言软件的Bioconductor生物信息软件包进行处理，得到GO功能富集分析(图4A、4B、4C)和KEGG通路富集分析(图5)，设定阈值P<0.05为标准进行筛选。

1.7 分子对接验证 利用分子对接技术研究小柴胡汤的活性成分及其治疗肝癌的相关靶点，能够在一定程度上说明活性成分与靶点蛋白的作用机制与结合活性[8]。从PDB(https://www.rcsb.org/)数据库下载关键靶点AKT1(PDB ID:4GV1)、ALB(PDB ID:1N5U)、JUN(PDB ID:2G01)、MYC(PDB ID:1EE4)、VEGFA(PDB ID:1MKK)、IL6(PDB ID:1N26)的PDB格式，从Pubchem数据库下载关键活性成分槲皮素、山奈酚、汉黄芩素、柚皮素、β-胡萝卜素、黄芩素sdf格式的3D结构。采用Autodock Tools 1.5.6中的Edit模块对蛋白进行加氢、计算电荷、添加原子类型等操作，采用Torsion Tree模块判定配体的root并选择配体可扭转的键，完成后导出pdbqt格式的受体蛋白和小分子，采用Autodock Vina进行分子对接，采用Discovery Studio2020可视化分析对接构象。

2 结果

2.1 活性成分及靶点的筛选 检索TCMSP数据库中小柴胡汤所有成分及相关靶点，对筛选出的靶点添加基因名。根据OB和DL对小柴胡汤中的活性成分进行筛选，分别得到柴胡活性成分17个、黄芩活性成分36个、半夏活性成分13个、甘草活性成分92个、人参活性成分22个、生姜活性成分5个、大枣活性成分29个。

2.2 肝癌的靶点筛选 以“liver cancer”为关键词，检索GeneCards数据库，得到靶点1 004个，检索OMIM数据库，得到靶点495个，删除重复靶点后，共得到疾病相关靶点1 404个。

2.3 小柴胡汤-肝癌靶标的构建 利用在线作图工具Venny 2.1，输入小柴胡汤活性成分靶点258个和肝癌疾病靶点1 402个，两者取交集后得到127个交集靶点(见图1)。

图1 小柴胡汤与肝癌靶点

2.4 化合物-活性成分-靶点网络的构建 活性成分-靶点网络包括135个化合物节点，279个靶点节点以及1 378条边构成。拓扑结果显示，“degree”值较高的成分是槲皮素(quercetin，MOL000098)，山奈酚(kaempferol，MOL000422)，汉黄芩素(wogonin，MOL000173)，柚皮素(naringenin，MOL004328)，β-胡萝卜素(beta-carotene，MOL002773)，黄芩素(baicalein，MOL002714)等，小柴胡汤主要通过135个活性成分作用于127个靶标基因，这127个靶标基因可能影响肝癌的发生。

图2 化合物-活性成分-靶点调控网络

2.5 靶点蛋白互作网络(PPI)的构建 在STRING v11.0数据库构建靶蛋白PPI网络，物种设为“Homo sapiens”，最低相互作用阈值设为中等置信度“Medium confidence”为0.4，其余参数保持默认设置。蛋白互作网络中“degree”值较高的靶点是AKT1、ALB、JUN、MYC、VEGFA、IL6等，提示这些靶点可能是小柴胡汤治疗肝癌的关键作用靶点。

2.6 GO功能富集分析 将上述得到的127个交集靶点通过R语言的Bioconductor生物信息软件包进行GO功能富集分析。GO功能富集分析主要包括生物过程(biological process，BP)(图4A)，细胞组分(cellular component，CC)(图4B)和分子功能(molecular function ，MF)(图4C)三部分。

2.7 KEGG通路富集分析 通过R语言软件的Bioconductor生物信息软件包进行KEGG通路富集分析后，富集比较明显的前20个通路(图5)包括：PI3K-Akt信号通路、丙型肝炎、乙型肝炎、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、人巨细胞病毒感染、EB病毒感染、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、凋亡、IL-17信号通路、内分泌抵抗、肿瘤坏死因子信号通路等。

图3 小柴胡汤治疗肝癌的PPI网络

4A 生物过程

4B 细胞组分

4C 分子功能图4 GO功能富集分析结果

图5 KEGG通路富集分析气泡图

2.8 核心成分的分子对接验证 一般认为结合能越低，配体与受体结合越稳定，≤-5.0 kcal/mol说明两者可以结合，≤-7.0 kcal/mol说明两者有较好的结合能力[9]。分子对接结果显示，槲皮素、山奈酚、汉黄芩素、柚皮素、β-胡萝卜素、黄芩素与AKT1、ALB、JUN、MYC、VEGFA、IL6有较好的结合能力。

2.9 分子对接结合模式分析 a、b环均与Asp292、Glu191形成π-阴离子作用；c环与Leu295形成π-sigma作用，其酚羟基与Lys276、Asp274形成氢键作用, 见图6-1(B)2D作用图和图6-1(C)3D作用图。a环与Val164形成π-sigma作用；c环与Val164、Ala177、Ala230形成疏水作用，与Met281形成硫-π作用, 见图6-2(B)2D作用图和图6-2(C)3D作用图。a环与Tyr138、Tyr161形成π-π堆积作用；b环与Tyr138形成酰胺-π堆积作用，与Tyr161形成π-π堆积作用，与Ile142形成疏水作用，其羟基与Leu135形成氢键作用；c环与Tyr161、Phe157形成π-π堆积作用，与Ile142形成疏水作用, 见图6-3(B)2D作用图和图6-3(C)3D作用图。a环与Val158、Ile32形成疏水作用，与Met111、Asn114形成氢键作用；b环与Val158、Ile32、Ala53、Val40形成疏水作用，其羰基与Met111、Leu110形成氢键作用；c环与Met108形成硫-π作用，与Val40、Lys55形成疏水作用，见图6-4(B)2D作用图和图6-4(C)3D作用图。a、b环均与Trp195形成π-π间环堆积效应；b环羟基与Ser230形成氢键作用；c环与Glu191形成π-阴离子作用，其酚羟基与Glu192形成氢键作用，见图6-5(B)2D作用图和图6-5(C)3D作用图。a环与Leu149形成疏水作用；b、c环均与Glu191形成π-阴离子作用；c环酚羟基与Ser230形成氢键作用，见图6-6(B)2D作用图和图6-6(C)3D作用图。a环与Met94形成硫-π作用，与Arg82形成π-阳离子作用，与Gly92形成氢键作用；b环与Met94形成疏水作用，与Glu42形成π-阴离子作用；c环与Met94形成疏水作用，与Ser95、Tyr39形成氢键作用，见图6-7(B)2D作用图和图6-7(C)3D作用图。a环与Pro121、Pro117、Pro95形成疏水作用，与Thr120形成酰胺-π堆积作用，与Glu96形成氢键作用；b环与Val93形成π-sigma作用；c环与Val93形成疏水作用, 见图6-8(B)2D作用图和图6-8(C)3D作用图。

图6-1 槲皮素与AKT1相互作用图

图6-2 柚皮素与AKT1相互作用图

图6-3 山奈酚与ALB相互作用图

图6-4 汉黄芩素与JUN相互作用图

图6-6 黄芩素与MYC相互作用图

图6-7 槲皮素与VEGFA相互作用图

图6-8 汉黄芩素与IL6相互作用图

3 讨论

本资料通过网络药理学方法，构建方中活性成分与肝癌交集靶点的蛋白互作网络，推测槲皮素、山奈酚、汉黄芩素、柚皮素、β-胡萝卜素、黄芩素等可能是本方发挥作用的重要成分。分子对接提示，核心成分与肝癌关键靶点AKT1、ALB、JUN、MYC、VEGFA、IL-6之间均表现出了良好的对接活性。

槲皮素抑制了肝癌细胞的迁移和侵袭能力，使肝癌细胞恶性程度降低，防止了肝癌细胞的转移和扩散[10]。山奈酚可以明显抑制人肝癌细胞的生长，经山奈酚处理的人肝癌Huh7细胞,细胞凋亡特征明显,且随着作用时间的延长, 细胞凋亡率逐步增高[11]。冯永波等[12]发现汉黄芩素可抑制人肝癌HepG2细胞的增殖, 具有明显的抗肿瘤效果。通过Western Blot法检测了汉黄芩素作用前后人肝癌SMMC-7721细胞中Pro-caspase-9和Pro-caspase-8表达水平的变化,汉黄芩素对肝癌细胞的作用机制是通过线粒体信号通路实现的[13]。柚皮素是食物中常见的类黄酮物质，研究[14]发现柚皮素可以抑制多种肿瘤细胞的生长，并且对正常细胞无明显细胞毒作用。流行病学研究[15]表明，在膳食中补充富含β-胡萝卜素或类胡萝卜素果蔬，可以使各种恶性肿瘤的发生率较低。黄芩素能下调肝癌干细胞中诱捕受体3的表达，进而影响肝癌干细胞的生长、细胞周期、细胞凋亡和细胞迁移这一系列生物学行为[16]。

研究[17]表明，AKT1基因rs1130214位点基因多态性可能与原发性肝癌的发生有关,突变基因型(GT+TT)可能是原发性肝癌的易感基因。肝细胞癌患者常伴有肝脏功能异常以及伴随的患者整体的营养消耗[18]。张颖超等[19]研究结果显示, c-fos和c-jun在正常肝组织中只有低水平表达或不表达, 而在癌旁异型增生肝组织中均有表达,提示c-fos和c-jun的异常表达可能与HCC的发生密切相关，而使c-fos和c-jun灭活或下调其表达水平可能成为预防和治疗HCC的一种新方法。谢斐[20]首次发现miR-320a在肝癌组织和肝癌细胞系中可以抑制靶基因c-Myc的表达，并发现通过抑制c-Myc可以抑制肝癌细胞增殖能力和侵袭能力。在肝癌细胞系BEL-7402 中，miR-195 能够打靶肿瘤血管生成相关蛋白 FGF2和VEGFA[21]。血管内皮生长因子A(VEGFA)，是最重要的促血管生成介质之一，直接作用于内皮细胞，并激活 PI3K、ERK 及 AKT 等信号传导通路，与肝脏恶性肿瘤的发生及预后有着密切的关系[22]。冀彤[23]发现IL-6通过调控NK细胞介导的肿瘤免疫监视抑制肝癌的发生发展。杜忠良等[24]研究发现，黄芩素抑制肿瘤生长，诱导肿瘤细胞凋亡和VEGF的表达可能与PI3K/AKT通路被抑制相关。

肿瘤的发生和发展与细胞应答各种应激的不同反应密切相关。长期性的病毒感染、负面精神情绪、不良生活行为等形成的慢性应激,往往促进肿瘤的发生[25]。在癌症中，氧化应激水平通常会增加，肝癌细胞的高增殖能力和持续性炎症，都与氧化应激有关。氧化应激一方面直接在DNA上形成8-oxo G或脂质过氧化引起畸变，另一方面通过表观遗传机制促进肝癌发生[26]。研究[27]表明在营养成分如葡萄糖缺乏的条件下，肝癌细胞从糖酵解途径产生的ATP减少，为了维持ATP的稳态，肝癌细胞通过动员甘油三酯，经过脂肪分解产生ATP满足自身需要，从而抵抗应激反应。

研究[28]证实，PI3K-Akt信号通路可以抑制肝癌细胞迁移、侵袭和转移。流行病学研究[29]表明，乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)感染、黄曲霉素、饮水污染、酒精、肝硬化、亚硝胺类物质、微量元素等都与肝癌发病相关。乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)是引起肝细胞癌(HCC)的主要原因。在世界上HCC发病率最高的国家如中国、韩国等，发现HBV和HCV阳性的比例均很高[30]。

由于网络药理学和分子对接方法尚存在一定的局限性，本资料旨在为后期进一步探讨小柴胡汤治疗肝癌的机制奠定理论基础。