理筋手法对颈肌慢性静力性损伤兔下丘脑和脊髓β-EP和CCK-8含量的影响

李嫚嫚，马惠昇，穆 静，李彦双，袁兰英

(宁夏医科大学 中医学院，宁夏 银川 750004)

慢性静力性损伤是日常生活中常见的损伤类型，如果在工作生活中较长时间处于某种强迫体位或不自然的姿势，使肌肉处于持续性紧张状态，将会导致局部软组织出现疼痛、肿胀、功能障碍等症状，触诊局部常见皮下条索状物或结节[1-2]，严重影响患者的生活质量。临床研究表明，理筋手法治疗慢性静力性损伤有独特疗效。本研究拟采用长期反复屈曲家兔颈椎法，建立家兔颈肩部软组织慢性静力负荷损伤疼痛模型，对模型家兔施以理筋手法，通过测定中枢疼痛相关物质含量观察理筋手法对静力性损伤模型兔损伤的治疗效果，以期探索理筋手法镇痛效应的实验依据。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

酶标仪(芬兰Labsystems Multiskan MS公司，型号：352型)；洗板机(芬兰Thermo Labsystems公司，型号：AC-8)；离心机(国产微量高速离心机，型号：TG16W)；吉尔森P型移液器(Pipetman)；电热恒温培养箱(南京实验仪器厂，型号：HG303)。

1.2 试剂

兔β内啡肽(β-EP)酶联免疫试剂盒(货号：XY-β-E P-Rb，批号：E20191212161252)、兔胆囊收缩素8(CCK-8)酶联免疫试剂盒(货号：XY-CCK-8-Rb，批号：E201912161325)均由上海信裕生物科技有限公司生产。

2 实验方法

2.1 实验动物与分组

选用健康成年日本大耳白兔70只，6月龄，体质量2.0～3.0kg，雌雄各半，由宁夏医科大学实验动物中心提供。各组兔均在宁夏医科大学实验动物中心分笼喂养，食用标准兔饲料。将实验兔分为空白组(5只)：不造模也不做任何处理，笼中正常饲养，用于试验中的空白对比；模型组(5只)：按照模型制备方法连续造模60天；自然恢复组(30只)：按照模型制备方法连续造模60天后停止，观察造模家兔的自然恢复过程，分别于造模后第10天、第20天、第30天时处死10只兔进行观察；治疗组(30只)：造模时间与方法同模型组，造模60天后停止造模，开始给予理筋手法治疗，治疗期间动态观察，分别于治疗第10天、第20天、第30天处死10只兔进行观察。

2.2 造模方法

自制造模固定架(图1)：采用韧性较好的细钢筋焊制，头部折成 U字形，固定兔的头颈部，然后U字两边对称折成Z字形，用于固定前双腿部，Z字后部延长约15 cm，并于8 cm左右处折弯钩，弯钩用于固定兔腰部。造模后如图2所示，本固定架使造模兔颈部活动受限，但其他部位活动不受限制，且对造模兔的呼吸道影响较小。造模时将兔颈椎保持前屈位5 h，松解后笼中自由饲养，每天1次，连续2个月。

图1 造模固定架

图2 造模后的状态

2.3 理筋手法

根据筋伤疼痛治疗应活血散筋的原则，选用松筋、拨筋、顺筋法，由操作熟练者进行，手法刺激量为2 kg。操作时将家兔固定在手法测定仪测力平台上，在兔枕骨髁下至第一胸椎部位，先用大拇指和食指指腹着力于颈椎两侧，上下来回拿揉颈肩部软组织以松筋，力量2 kg，频率100次/min，持续5 min；再用拇指拨筋，力量2 kg，持续5 min，频率为80次/min；最后用顺筋法，即用拇指指腹自枕骨髁下至第一胸椎局部顺毛推捋，力量2 kg，频率80次/min，持续5 min。每次治疗时间为15 min。

2.4 观察指标及检测方法

中枢疼痛相关物质检测：采用双抗夹心 ELISA法分别检测各组兔颈段脊髓和下丘脑中β-内啡肤(β-EP)、八肽胆囊收缩素(CCK-8)的含量。

2.5 统计学方法

3 结果

3.1 各组家兔脊髓、下丘脑中β-内啡肽表达水平比较

造模后，模型组兔脊髓中β-EP含量较正常组升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，自然恢复组(10 d，20 d，30 d)和治疗组(10 d，20 d，30 d)兔脊髓中β-EP的表达均有显著差异(P<0.05)。自然恢复组兔第10天、20天脊髓中β-EP含量均显著低于自然恢复组(P<0.05)。自然恢复组兔第30天脊髓β-EP含量与治疗组第30天无显著差异(P>0.05)。

造模后，模型组兔下丘脑中β-EP含量较正常组升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，治疗组(10 d，20 d，30 d)下丘脑中β-EP的表达有显著差异(P<0.05)，自然恢复组(10 d，20 d，30 d)无显著差异。自然恢复组兔第10天、20天下丘脑中β-EP含量均显著低于治疗组相应时间(P<0.05)，但第30天两组兔丘下脑β-EP含量无显著差异(P>0.05)。详见表1。

3.2 各组家兔下丘脑CCK-8表达水平比较

造模后，模型组兔脊髓中CCK-8含量较正常组升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，自然恢复组兔(20 d，30 d)和理筋手法治疗组(20 d，30 d)脊髓中CCK-8的表达有显著差异(P<0.05)，自然恢复组兔10 d、20 d脊髓中CCK-8含量显著高于治疗组(P<0.05)，但30 d时无显著差异(P>0.05)。

表1 各组兔脊髓和下丘脑中β-EP含量比较

造模后，模型兔下丘脑中CCK-8含量较正常组升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，自然恢复组(20 d，30 d)和理筋手法治疗组(10 d，20 d，30 d)下丘脑中CCK-8的表达有显著差异(P<0.05)，自然恢复组(10 d)无显著差异(P>0.05)。自然恢复组兔10 d下丘脑中CCK 8含量显著高于治疗组(P<0.05)，但20 d、30 d时无显著差异(P>0.05)。见表2。

表2 各组兔脊髓和下丘脑CCK-8含量比较

4 讨论

慢性静力性损伤是引起颈肩腰背部等周围软组织疼痛的常见原因[3]，临床一般采用口服止痛药物缓解疼痛，或者使用外用药物、针刀、理疗、神经阻滞等方法进行治疗[4]。理筋疗法是宁夏少数民族医学中治疗颈肩腰腿痛的主要手段，其操作简便，治疗效果佳，副作用相对较小，具有纠正小关节紊乱、解除痉挛、消除局部粘连、减轻炎症反应等作用。本实验采用家兔颈部长时间反复低头位，使颈肩部软组织反复经受静力性负荷刺激，诱发颈肩部软组织静力性损伤，建立家兔颈肌慢性静力性损伤疼痛模型，在后期施以理筋手法，观察脊髓和下丘脑中β-EP和CCK-8含量的变化，探讨理筋手法对慢性静力性损伤模型的镇痛效应。

β-EP是组成内源性阿片肽系统的重要部分之一，主要分布在下丘脑和垂体。β-EP在疼痛调节中作为抑制性神经递质，具有吗啡样活性和调控疼痛信息传递的作用，在伤害性感觉中发挥重要作用[5-6]。生理状态下β-EP的含量较少，在病理刺激下，其含量升高，通过μ和δ阿片受体产生抗痛觉过敏或镇痛作用[7-8]。造模后的慢性静力性损伤兔的β-EP水平均高于空白组。治疗组和自然恢复组家兔不同时间点脊髓和下丘脑中β-内啡肽的变化不尽相同。模型组兔β-EP含量较空白组明显升高，可能因为长期的静力性损伤使得机体自身产生修复反应，包括体内一些炎症因子的释放，通过不同因子的趋化作用和损伤修复作用，引起脊髓和下丘脑β-内啡肽含量升高，从而对机体产生一定的保护作用；自然恢复组β-EP含量在10 d时开始下降，但治疗组高于自然恢复组，可能因为自然恢复组中β-内啡肽含量在没有其他治疗方法辅助的情况下升高时间不够持久，对机体的镇痛效果并不理想。治疗组10 d脊髓和下丘脑β-内啡肽的含量达到峰值。

CCK有许多存在形式，最主要的是八肽胆囊收缩素(CCK-8)，已发现的受体为CCKA和CCKB，CCK可能通过兴奋CCKA受体与内源性阿片系统协同抑制伤害性信息的传入，而通过作用于CCKB受体抑制内源性阿片的镇痛效应，从而双向调节伤害性信息的传入[9-10]。CCK-8是现阶段已知脑内含量最多的神经肽之一，存在于中枢神经系统和胃肠道中，并且具有多种调节作用，其中之一是其对疼痛感受具有调整作用[11]。并有研究指出，CCK-8和β-EP作为一对互相拮抗的因子，共同参与了镇痛作用[12]。本实验结果显示，模型组兔脊髓和下丘脑内CCK-8含量明显增加，可能因为静力损伤时，局部炎症持续存在刺激CCK-8的表达升高而产生痛觉过敏现象。治疗组和自然恢复组兔脊髓和下丘脑中CCK-8含量较模型组降低，但治疗组低于自然恢复组，说明理筋手法可降低兔脊髓和下丘脑内升高的CCK-8含量，使其更快接近于正常水平，提示理筋手法可能通过抑制中枢CCK-8的合成，减少对阿片肽的拮抗作用，达到中枢镇痛的目的。

综上所述，理筋手法可能通过提高β-EP的表达及降低CCK-8的表达参与中枢镇痛过程，至于这些物质对疼痛的具体调控机制则有待于进一步研究。