二倍体马铃薯皮绿原酸含量的研究

杨慧芹，张丽颖，余万都，尚 轶，马 玲

(云南师范大学 马铃薯科学研究院，云南 昆明 650500)

马铃薯(SolanumtuberosumL.)，茄科茄属，其块茎可供食用，是一种具有高含量植物营养素的植物，享有“能源植物”、“第二面包”等多种美誉[1-2].作为全球四大重要的粮食作物之一，马铃薯既可以作为蔬菜制作佳肴，亦可作为主食，食用方法多种多样，口感风味上佳[2-3]，深受大众喜爱，甚至一些欧美国家已经将其当成一种健康的保健食品.马铃薯具有较高的经济价值[3-4]、 营养价值[5-6]以及药用价值[6]及诸多附加值高的可利用价值仍在不断研究开发中.

马铃薯中的酚类化合物是其重要的次级代谢产物，具有很强的抗氧化和清除自由基的能力[7]，主要包括绿原酸、咖啡酸、香豆酸、没食子酸等[7-9].酚类物质在马铃薯块茎中并不是均匀分布的，薯皮中的总酚含量高于薯肉中的总酚含量，越靠近块茎中心，其浓度越低[9-12].绿原酸是所有单体酚类物质中含量最高的酚酸类化合物[12]，主要存在于马铃薯的表皮以及邻近组织中[9-10,12].

绿原酸(Chlorogenic acid,CGA)，又名咖啡单宁酸，由酯类家族中某些反式肉桂酸(如咖啡酸、奎尼酸)构成，是一种分布广泛且具有独特生物活性的天然化合物[13-14].绿原酸是植物体有氧呼吸过程中产生的缩酚酸化合物，是许多中草药的有效药理成分之一[13,15].绿原酸对清除自由基和抗脂质过氧化的作用显著，具有抗氧化作用及多种药理活性，如：心血管保护作用、抗紫外线和抗辐射、抗诱变和抗癌、抗菌和抗病毒、还可以降脂降血糖、保肝利胆等[10,15-16].近年来，国内外对绿原酸的分布、生理活性以及生物合成途径进行了多层次的研究，随着实验开发和临床实践，绿原酸在食品、化工和医药卫生等行业得到广泛应用.绿原酸主要从天然植物中提取，目前已经开发利用的绿原酸原料有金银花、杜仲等，但随着对绿原酸需求的增加，应充分利用一些植物的副产品[17]，如：水仙花叶[18]、马铃薯等，这样不仅丰富了绿原酸开发的原料来源，还提高了副产品的综合利用率.

马铃薯绿原酸等酚类物质主要存在于马铃薯皮中，马铃薯皮作为马铃薯生产加工的副产品，经常被当作废弃物处理，这样不仅会对环境产生影响，还浪费材料资源.近年来，随着农业废弃物资源化利用的发展，越来越多人重视马铃薯皮的资源利用，以提高马铃薯产业的附加值.马铃薯皮中含有丰富的活性成分，已经大量文献展现了马铃薯皮中各生物活性物质的功能及其应用方向.马铃薯皮作为一种低价值的原料，可用于食品、医药等领域，马铃薯皮的多样化利用不仅可以为马铃薯加工产业带来经济效益，还可以减少废物产量和降低其对环境的污染，实现资源的最大化利用.

图1 绿原酸结构式

相较于四倍体马铃薯来说，二倍体马铃薯具有染色体少、遗传背景简单、生命力强、易于人工培养等优势，具有更加广泛的利用价值[19]，更适宜作为实验材料.本文利用丰富的二倍体马铃薯资源，以不同亚种的二倍体马铃薯为材料，对其薯皮中绿原酸含量进行测定分析，为马铃薯薯皮的资源化利用、育种、栽培等提供实验基础.

1 实验与方法

1.1 材料与设备

二倍体马铃薯材料选择3个分类亚群Substenotomum、Goniocalyx和Phureja，采集于云南师范大学马铃薯实验基地，田间管理按常规管理.薯块收获后，选择无机械损伤、大小均一、无绿变、新鲜的马铃薯块茎，用清水洗净表面污物并擦干水分后用不锈钢刀具削取 0.5 cm 厚的马铃薯皮，液氮速冻后用ALPHA1-2LD plus 真空冷冻干燥机冻干，研磨成粉末.

ALPHA1-2LD plus真空冷冻干燥机；FA1004N电子分析天平；JP-031S 超声波清洗机；H2100R冷冻离心机；UV-2800型紫外可见分光光度计.

1.2 绿原酸的提取与测定

采用紫外分光光度法，参照文献[20]的方法稍作修改：准确称取 0.2 g 马铃薯皮冻干粉，加入 2 mL 75%乙醇提取液，室温下超声波辅助萃取 30 min，萃取结束后，4 ℃， 12 000 r/min 离心 2 min，取上清液适当稀释后用2800UV-VIS紫外-可见分光光度计于 327 nm 波长下检测吸光度，以75%乙醇为空白对照.根据标准曲线计算绿原酸含量.

标准曲线制作：以75%乙醇为溶剂，先配制成 100 mL 含绿原酸 20 mg 的溶液，再依次配制成 100 mL 中含绿原酸0.5、1.0、1.5、2.0 mg 的4种绿原酸标准溶液.取 2 mL 绿原酸标准溶液于 327 nm 处测出各标准溶液的吸光值，以 2 mL 75%乙醇代替绿原酸标准溶液作为空白.以系列标准绿原酸浓度为横坐标，对应的吸光值为纵坐标.

1.3 数据分析

采用SPSS16.0对各系列绿原酸含量进行统计分析.

2 结果与分析

2.1 不同二倍体马铃薯材料进化分析

本试验以二倍体马铃薯农家种的3个分类亚群Substenotomum、Goniocalyx和Phureja为研究对象，它们的进化发育关系如图2所示.

图2 二倍体马铃薯资源系统发育树

从图1中可以看出，Goniocalyx和Phureja主要由Substenotomum进化而来，Goniocalyx的出现早于Phureja.

2.2 二倍体马铃薯皮中绿原酸含量的测定分析

2.2.1 标准曲线和线性范围的确定

取绿原酸标准品 20 mg 于 200 mL 瓶容量瓶中，用体积分数为75%的乙醇定容，制成 100 μg/mL 的绿原酸标准溶液.分别精密吸取 100 μg/mL 绿原酸标准溶液1、1.2、1.4、1.6和 1.8 mL 于 10 mL 容量瓶中，用75%乙醇定容，制备得质量浓度为10、12、14、16、18 μg/mL 的绿原酸标准溶液.以 2 mL 75%乙醇作为空白，取 2 mL 绿原酸标准溶液于 327 nm 处测出各浓度绿原酸标准液的吸光度，以系列标准绿原酸浓度为横坐标(X)，对应的吸光值为纵坐标(Y)，绘制标准曲线.

绿原酸标准曲线如图4所示，线性回归方程为y=0.047 5x+0.014 34，r2=0.990 3(n=6).其中，y是吸光度值，x是绿原酸溶液的浓度，计算得线性范围为10～180 μg/g.在样品绿原酸含量测定过程中，高浓度的样品需进行适当的稀释后方可进行测定.

图3 马铃薯绿原酸的吸收光谱 图4 绿原酸标准曲线

2.2.2 不同二倍体马铃薯品种薯皮中绿原酸含量

Goniocalyx、Phureja和Substenotomum每个亚种中选取15个编号进行薯皮中绿原酸含量的测定，结果见表1.

表1 二倍体马铃皮中绿原酸的含量 (μg·g-1)

由表1和图5可知：不同亚种马铃薯皮中的绿原酸含量不相同，Substenotomum薯皮中的绿原酸含量最高为 4 019.22 μg/g，最低为 2 422.70 μg/g；Goniocalyx薯皮中的绿原酸含量最高为 4 411.09 μg/g，最低为 2 546.07 μg/g；Phureja薯皮中的绿原酸含量最高为 8 579.45 μg/g，最低为 5 194.83 μg/g.绿原酸合成中通过奎尼酸羟基肉桂酰基转移酶(HQT)合成绿原酸的途径是其主要的合成途径[21].在马铃薯中沉默HQT基因可导致绿原酸合成减少90%以上[22]，据此推断Phureja二倍体马铃薯皮中HQT蛋白的乙酰转移酶活性较高，能够催化合成绿原酸，从而导致其绿原酸含量较高.

图5 二倍体马铃薯材料薯皮中绿原酸的含量

图6 植物中绿原酸的3条生物合成途径

表2 二倍体马铃薯不同亚种间绿原酸含量统计分析表

经SPSS统计分析(表2)得出：Substenotomum和Goniocalyx2个亚种薯皮中绿原酸含量差异不显著；Substenotomum和Phureja个亚种薯皮中绿原酸含量差异显著(P<0.05)；Goniocalyx和Phureja2个亚种薯皮中绿原酸含量差异显著(P<0.05).

从以上结果可以看出：Phureja栽培亚种中绿原酸含量明显高于Substenotomum和Goniocalyx2个栽培亚种，符合3个亚种的基因组进化树分析，表明马铃薯绿原酸的代谢调控过程可能受到了驯化选择.

3 结语

本试验采用超声波辅助提取，结合紫外分光光度法，测定了3个亚种共45个二倍体马铃薯材料薯皮中的绿原酸含量.结果显示，不同马铃薯材料薯皮中的绿原酸含量不同，所测样品中薯皮绿原酸含量最低为 2 422.70 μg/g；最高为 8 579.45 μg/g；不同亚种马铃薯材料薯皮中的绿原酸含量也存在差异，Phureja亚种的绿原酸含量明显高于Substenotomum和Goniocalyx2个亚种.从进化程度上来看，与Substenotomum和Goniocalyx2个亚种相比较，进化程度相对较高的Phureja亚种的薯皮绿原酸含量较高，Phureja亚种中所测马铃薯样本的薯皮绿原酸含量最低为 5 194.83 μg/g，均高于其它2个亚种薯皮中绿原酸的最高含量.因此，马铃薯皮中绿原酸代谢调控可能与马铃薯的进化程度相关，但还有待进一步深入研究.