分子生物技术在川贝母鉴别中的应用展望

喻莹 陈建伟 陈志禹

摘 要 川贝母是中国最常用的化痰止咳贵重药草，贝母属植物种类繁多，各种属来源复杂，川贝母与其混伪品之间鉴别困难，近年来分子生物技术在川贝母鉴定中开始了大规模的应用研究，如PCR-RFLP、PCR-RAPD、SSR、PCRISSR、qPCR、DNA条形码、SNP、PCR-AFLP等技术的应用，并且展现出较好的应用前景。

关键词 分子生物技术 川贝母 鉴别

中图分类号：R282.5 文献标志码：A 文章编号：1006-1533（2021）05-0073-04

*基金项目：宁波市自然科学基金项目“realtime PCR用于检定川贝母掺伪情况的定量研究”（2018A610429）

Prospect of the application of molecular biotechnology in identification of Fritillaria cirrhosa*

YU Ying1**， CHEN Jianwei2***， CHEN Zhiyu2

（1. Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine， Hangzhou 310053， China； 2. Ningbo Institute for Drug Inspection， Zhejiang Ningbo 315000， China）

ABSTRACT Bulbus Fritillariae cirrhosae is phlegm cough precious herbs that is the most commonly used in China. There are many different kinds of plants of the genus Fritillaria and the sources of various genus are complex. The identification between Bulbus Fritillariae cirrhosae and the adulterants are difficult. Molecular biotechnology has begun a large-scale study in identification of Bulbus Fritillariae cirrhosae in recent years， such as PCR-RFLP， PCR-RAPD， SSR， PCR-ISSR， qPCR， DNA barcoding， SNP， PCR-AFLP and other technologies and shows a good application prospect.

KEY WORDS molecular biotechnology； Bulbus Fritillariae cirrhosae； identification

川贝母是百合科贝母属多年生草本植物，有淸热润肺，化痰止咳，散结消痈的功能。我国的药用贝母属植物超过50种，中国药典2015年版[1]共收录5大类贝母：川贝母、平贝母、伊贝母、浙贝母和湖北贝母，其中川贝母基原植物有： 川贝母（F. cirrhosa D. Don）、暗紫贝母（F. unibracteata Hsiao et K. C. Hsia）、甘肃贝母（F. przewalskii Maxim）、梭砂贝母（F. delavayi Franch）、太白贝母 （F. taipaiensis P. Y. Li）或瓦布贝母（F. unibracteata Hsiaoet K. C. Hsia var. wabuensis）。由于需求量大而资源少，优质川贝母价格昂贵，市场上存在用其他低价的近缘品种（如小平贝和伊贝母）充当川贝母出售的现象。中国药典2015年版规定的川贝母鉴别法主要有显微鉴别法、薄层色谱法以及PCR-RFLP法。近年来分子生物技术的应用，使其鉴定手段从传统形态表征扩展到了遗传物质DNA：核糖体上的ITS保守区序列、叶绿体上的psbA-tmH序列等，可定量、准确地对川贝母进行鉴别。本文就分子生物技术在川贝母鉴别中的应用及展望作一简单综述。

1 PCR-RFLP技术

PCR-限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）技术是以PCR技术为基础，扩增产物被限制性内切酶切割，产生不同长度的DNA条带，可通过条带灰度反应掺伪比例大小。早在2005年，Wang等[2]将RFLP技术应用于伊犁贝母的鉴别中，后逐渐应用于湖北贝母、平贝母、浙贝母、伊贝母等鉴别中，反应体系也逐渐优化。徐传林等[3]对PCR-RFLP技术进行改进：采用DNA快速提取试剂盒提取DNA；PCR扩增（预变性4 min，变性30 s，复性30 s，延伸30 s，最终再延伸5 min；循环次数为30次）；酶切（时间为2 h；DNA酶为SmaⅠ限制酶）；且PCR扩增、电泳、酶切步骤中RSD均小于10%，证明反应稳定性高。此方法不同实验室灵敏度可达50%以上[4]，适用范围广，结果稳定，技术较成熟，已被收录于中国药典2015年版川贝母鉴别项下。但药典采用的PCR-RFLP法无法进行定量检测，并且由于PCR法过于灵敏，掺入少量川贝母即可出现假阳性现象。赵仲麟等[5]的实验表明真品川贝母扩增产物含有SamⅠ酶切位点，在100～250 bp之间存在明确的2条酶切条带，而伪品中由于没有SamⅠ酶切位点而不能被切出该片段。此外，还进行了相对定量分析研究，含量10%及以上的真品川贝母能被稳定检测出。针对PCR-RFLP的貝母鉴别技术研究较多，相对其他分子鉴别技术，技术较成熟。

2 PCR-RAPD技术

PCR-随机扩增多态性DNA（random amplified polymorphic DNA，PCR-RAPD）标记技术是利用一系列（8～10个碱基）不同的随机引物，对所研究的基因组DNA进行PCR扩增，通过凝胶电泳分离来检测DNA片段多态性的技术。PCR-RAPD技术可以揭示高度的多态性，并且不需要设计引物，对模板DNA浓度要求较低。该方法简单明了，适合在中医药行业中应用。Xin等[6]利用RAPD技术对贝母种质资源的一个0.65 kb的DNA分子标记进行了鉴定。根据RAPD扩增产物开发了代表序列特征扩增区域（SCAR）的DNA标记。将SCAR标记成功用于川贝母种间鉴别。SCAR标记具有大规模分析的优点，成本低，重复性高，且易于使用，对比PCRRFLP鉴别法，不需要高质量DNA，无需预备性工作，不需设计引物。

3 SSR筛选

简单重复序列（simple sequence repeats，SSR）标记，又称微卫星标记，是一类由数个核苷酸为重复单位组成的重复序列。SSR筛选具体操作步骤包括：RNA提取及测序、SSR检测、PCR扩增、电泳、结果分析。将筛选出的川贝母的SSR序列，作为特异性序列，与伪品进行鉴别。早些年的研究曾尝试用通用分子标记来鉴别近源种贝母，但系统发育信号不足。张婕等[7]通过高通量测序在川贝母中检测到3 817个SSR位点，SSR出现频率为8.49%，平均每10.37 kb序列出现1个SSR位点，其中重复类型最多的为三核苷酸和二核苷酸，所占比分别为56.51%和27.06%，为川贝母的遗传标记和指纹图谱的开发提供了重要依据。

4 PCR-ISSR技术

PCR-内部简单重复序列（inter-simple sequence repeat，ISSR）是将锚定的微卫星DNA（即SSR序列的3端或5端加上2～4个随机核苷酸）作为引物，对重复序列之间的区域进行PCR扩增的方法。此方法不需要测序及设计引物，与RAPD方法类似。詹羽姣等[8]采用ISSR技术对新疆贝母进行遗传多样性分析，其中多态性条带为195条，占97.99%，遗传一致度（I）和遗传距离（D）分别为74.74%和0.301 4 cm，同样可将ISSR应用于川贝母的鉴别。ISSR还可与RAPD单独或联合应用于川贝母的遗传关系分析。

5 qPCR技术

实时荧光定量PCR技术（realtime fluorescence quantitative PCR，qPCR）是以免疫学原理为基础的一种新型技术。与其他不同的是，对目的基因扩增结果不是通过琼脂糖凝胶电泳来判断，而是通过荧光标记的特异性探针（通常为一寡核苷酸，两端分别标记一个荧光基团和一个淬灭基团），对PCR产物进行标记跟踪，实时监控反应过程，再计算Cq值，建立标准曲线，可以对样本含量定量计算。此技术在川贝母研究中的应用较少，仅国内有数篇报道[9-12]。王成等[9]以TaqMan为探针，通过筛选、特异性测试、扩增条件优化和方法灵敏度测试，形成一套川贝母物种特异性实时荧光PCR方法。在此基础上建立标准曲线，当引物终浓度1.2 μmol/L、探针终浓度0.6 μmol/L时，可检测川贝母含量低至0.05%的样品。qPCR的实验结果可通过Cq值和扩增曲线图来直观表示，可以实时监测反应过程，且反应特异性强、操作简单、用时少、准确率高，有很好的应用前景。表1将RFLP、RAPD、ISSR、qPCR之间进行了对比。

6 DNA条形码

DNA条形码（DNA barcode）是指生物体内能够代表该物种的、标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段。DNA条形码技术以PCR-RFLP技术为基础，将样品经过DNA提取→引物设计→PCR扩增→电泳→序列测定→多重序列对比及聚类分析的步骤，将DNA条形码与数据库进行对比。其中序列分析是最重要的环节，首先进行序列比对和人工矫正，通过软件计算种内和种间K2P距离，然后根据计算结果建立NJ树，最后根据遗传距离就能对样本进行分类和鉴定。其中ITS2序列是近几年的研究热点，ITS2是rRNA基因非转录区的一部分，它的序列变化较大，具有重复率、特异性高的特点。但ITS2不能将川贝母筛选到“种”，也容易造成实验污染。其他高效的DNA条形码序列还包括叶绿体基因组的psbA-trnH，rbcL，matK，psbK-psbI，atpF-atpH等，可以将川贝母与其混伪品有效地区分，成为近几年研究的热点。DNA条形码还可作为SSR、SNP等技术的实验基础，应用广泛。Zhong等[13]将DNA条形码技术与HPLC指纹图谱相结合，先是应用DNA条形码技术（ITS2具有最高的种间差异，种内距离为0.000 0～0.008 5 cm，种间距离为0.002 1～0.005 3 cm，平均距离为0.003 0 cm）识别出贝母属，后通过HPLC指纹图谱及主成分图进行聚类分析，将川贝母与其他类贝母区分开，为川贝母质量控制和鉴定提供依据。DNA条形码技术的准确率极高，且操作难度低，但DNA测序成本较高，且无法定量检测出掺伪含量。

7 单核苷酸多态性（SNP）标记技术

单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism， SNP）主要是指在基因水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。可通过比对两种或多种基因组全序列进行川贝母的鉴别。SNP标记技术不需要凝胶电泳，代之以DNA芯片技术，不再以DNA长度变化作为检测手段，而直接以序列变异作为标记。兰青阔等[14]应用多重序列比对、 SNP 筛选等生物信息学分析手段，对贝母属叶绿体基因组序列进行分析，贝母属植物序列大小在151 009～152 224 bp之间，序列一致性为97.22%，共发现SNP位点5 879个，其中川贝母类鉴别候选位点71个。该技术兼有PCR技术的灵敏性和测序技术的准确性，精密度在10%左右，且一次可检测96个样本，操作简单，与荧光信号结合还可定量检测样本含量，精密度在0.1%左右。但其價格昂贵，日常鉴别应用较困难。

8 PCR-AFLP技术

PCR-扩增片段长度多态性技术（amplified fragment length polymorphism，AFLP）是用两种酶切割出引物结合位点，后对酶切片段进行选择性扩增。AFLP具有RFLP的高特异性和PCR的高效性，可重复性好。徐金中等[15]将AFLP应用于浙贝母的遗传多样性的分析，多态性条带达67%以上，表明AFLP能检测到很丰富的多态性，具有在川贝母鉴别中应用的可行性。AFLP结合了RFLP与RAPD的优点，不足之处是费用高，步骤繁琐，反应条件要求高，应用于日常鉴别有一定困难，目前需要简化引物的筛选及优化实验条件。

9 小结与展望

分子生物技术是一种较为先进的技术，具有较高的特异性和灵敏度。此技术种类繁多，其中以分子中的DNA检测为主，但DNA分子較少，往往不能被直接检测到，但运用PCR技术，可以将提取到的DNA进行扩增，近年来以PCR为基础的多种分子生物技术发展迅速，广泛应用于川贝母及其他中药材的鉴定之中。

目前PCR相关鉴别法前景较好，操作也正趋向简易、成熟。PCR-RFLP及PCR-RAPD的相关研究较广泛，技术较成熟，结果稳定可靠，但操作耗时耗力，最适反应条件及酶切体系等正在进一步完善；RAPD采用随机引物，但稳定性及重复性低，提高实验稳定性尤为重要；SSR序列广泛分布于川贝母DNA中，但需要测序，实验成本较高，可作为ISSR技术的实验基础，不适于平时鉴别工作；ISSR技术使用的是随机引物，实验成本较低，操作较简易，且目前的已知序列充足，开发SSR序列难度并非十分困难，将其应用于川贝母研究前景应该很好；qPCR技术可对川贝母进行准确定量分析，且精确度极高，目前在川贝母方面的研究相对较少，对于此技术的实验步骤及条件的确立研究意义重大且前景较好；DNA条形码是准确性最高的技术之一，但目前的数据库仍需进一步完善，且实验成本高，无法定量测定，与HPLC等化学测定技术相结合或将成为研究热点；SNP筛选可将分子鉴定具体到核苷酸，但实验成本较高。这些方法都是以PCR技术为基础的，对川贝母的鉴别也都意义重大，各实验室可根据自己的实验意义、经费、实验条件等因素选择适合自己的技术。

常用的RFLP、RAPD等方法无法满足大量样品的检测，但AS-PCR（等位基因特异性PCR）采用特异性引物，可将具有共同引物的样本同时进行多重PCR鉴别（在一个PCR反应中实现多个目标序列的同步扩增），具有高通量性，可同时检测几十甚至上百个样本，对数据库的建立意义较大；分子生物技术还可与质谱法、统计学、多元分析法等方法相结合，更加全面准确地鉴别出川贝母的混伪品。生物芯片、mRNA差异显示技术等已被应用于其他中药材的鉴别，如刘润南等[16]运用底芯片法和盖芯片法筛查双黄连注射剂中的致敏性成分；黎洁文等[17]应用mRNA差异显示技术筛选何首乌中二苯乙烯苷合成相关基因。但这些暂未应用于川贝母的鉴别，将此类方法进行优化，同样有望应用于川贝母的真伪鉴别。目前川贝母鉴别方法虽多，但部分技术属新型技术，研究不够透彻，故完善已有技术及寻找新方法对川贝母的鉴别均有重大意义。

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