安阳地区副猪嗜血杆菌分离株的耐药性与耐药基因检测

王庆云

(安阳市动物疫病预防控制中心，河南安阳 455000)

副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis，Hps)是养猪业中重要的细菌性传染病病原之一，在美国、英国、澳大利亚等多个国家及我国多个地区普遍流行，在发病过程中，经常与猪蓝耳病、猪圆环病毒病混合感染，给养猪业造成严重的经济损失[1-2]。副猪嗜血杆菌对各个年龄段具有易感性，主要侵害4周龄～8周龄仔猪，临床中主要表现为纤维素性胸膜炎、关节炎及脑膜炎等多种症状，仔猪病死率可达50%以上[3-4]。临床中Hps可以分为15个血清型，近几年分离的菌株未能鉴定出血清型，且不同的地区流行的血清不同，各种血清型的Hps没有完全交叉保护性[5-6]。抗生素长期不合理使用导致副猪嗜血杆菌的耐药性，耐药基因是细菌产生耐药性的重要因素[7-8]。 本试验从安阳地区养殖场采集患病猪的肺脏、肝脏、关节渗出液等病料组织157份，分离得到了102株副猪嗜血杆菌，对分离菌株进行耐药性和耐药基因检测，为该地区副猪嗜血杆菌的防控奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源 2019年3月至6月，采集安阳地区不同养殖场中患病仔猪的肺脏、肝脏、关节渗出液等病料组织157份。

1.1.2 主要试剂 巧克力培养基、70 mL/L绵羊血培养基、胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)，均购自北京奥博星生物技术有限公司；生化试纸条、药敏纸片，均购自浙江天杭生物科技股份有限公司；2×TaqMarker Mix购自北京康为世纪生物科技有限公司；DNA Marker DL 1 000购自北京中科瑞泰生物公司。

1.1.3 仪器设备 多功能梯度PCR仪，美国ABI公司产品；凝胶成像系统，美国伯乐公司产品；恒温培养箱和恒温水浴锅，上海恒一科技有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离与鉴定 采集患病猪的肺脏、肝脏、关节渗出液等病料组织放入无菌采集管(无菌的PBS)，无菌条件下接种于70 mL/L绵羊血培养基上，在37℃恒温箱中培养18 h～24 h，挑取单个菌落巧克力培养基上，37℃恒温箱中培养24 h～36 h，挑取巧克力培养基上的单个菌落在TSB进行纯化培养后，革兰氏染色、镜检观察其形态学。

1.2.2 生化鉴定 按照生化试剂的说明书将分离菌株接种于生化试剂管中，37℃恒温箱中培养24 h～36 h后，进行生化鉴定。

1.2.3 分离菌株的PCR鉴定 参考文献[4]，设计副猪嗜血杆菌16S rRNA鉴定引物 P1：5′-GTGATGAGGAAGGGTGGT-3′，P2：5′-GGCTTCGTCACCCTCTGT-3′。目的基因片段821 bp，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。用水煮法提取分离菌株的DNA基因组，进行 PCR扩增， 其PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，测序结果与GenBank中登录参考株进行同源性分析。

1.2.4 细菌的药敏试验 参照美国临床检验标准委员会(NCCLS)推荐的标准KB纸片法进行药敏试验，按照CLSI的标准判断耐药(R)、敏感(S)或中介(I)进行耐药性结果判断。

1.2.5 细菌的耐药基因检测 参考文献[9-10]，设计β-内酰胺类4种耐药基因(TEM、SHV、OXA、DHA)，磺胺类2种耐药基因(SulⅠ、SulⅡ)，四环素类2种(TetA、TetB)，酰胺醇类(氟苯尼考)1种耐药基因folR，大环内酯类2种耐药基因(ermA、ermB)，林可酰胺类耐药基因lnu(C)，喹诺酮类4种耐药基因(gyrA、gyrB、qnrA、qnrB)等16种耐药基因。用1.2.3制备基因DNA为模板，用梯度PCR进行耐药基因检测。

2 结果

2.1 细菌分离与培养结果

疑似副猪嗜血杆菌在70 mL/L绵羊血培养基上长出边缘整齐的、圆形的、灰白色菌落；在巧克力培养基上长出表面光滑的、圆形的、隆起的、整齐的、灰白半透明的菌落。革兰氏染色镜检结果，分离菌株呈革兰氏阴性，为杆状、短杆状等多形性形态。

2.2 细菌生化鉴定结果

分离菌株接触酶试验呈阳性，脲酶、氧化酶、鸟氨酸脱氢酶、吲哚试验均呈阴性，能分解果糖、蔗糖、葡萄糖、半乳糖、麦芽糖和阿拉伯糖；不分解甘露醇；为阴性。102株分离菌株初步鉴定为副猪嗜血杆菌。

2.3 细菌PCR鉴定结果

分离的102株菌株用副猪嗜血杆菌16S rRNA引物均扩增出约为821 bp的目的基因(图1)。测序结果显示，分离菌株的测序结果与GenBank库中登录的副猪嗜血杆菌参考株基因序列的同源性为97%～99%。说明分离的102株菌株为副猪嗜血杆菌。

M.DNA标准DL 1 000 ；1～9.分离菌株M.DNA Marker DL 1 000；1-9.Isolated strains

2.4 细菌耐药性结果

临床分离的102株副猪嗜血杆菌对14种抗菌药物产生不同的耐药性。对青霉素、阿莫西林、庆大霉素、红霉素、大观霉素、多黏菌素、磺胺间甲氧嘧啶7种药物耐药性最高，耐药率90.2%～98.0%；对替米考星林可霉素、氟苯尼考3种药物耐药率44.1%～56.9%；对头孢噻呋、头孢噻肟、环丙沙星、恩诺沙星、林可霉素4种药物耐药率较低，耐药率9.8%～26.5%(表1)。 分离株呈现多重耐药性，耐14种药物有2株、耐13、7种药物各6株、耐12、5种药物各7株、 耐11种药物有18株、耐10种药物有22株、耐9种药物有21种、耐8种药物有21株、耐8种药物有9种、 耐6种药物有4株。其中耐11、10、9种药物菌株最多，分别占分离菌株的17.6%、21.6%、20.6%(表2)。

表1副猪嗜血杆菌分离株的耐药性检测结果

2.5 细菌耐药基因检测结果

分离菌株携带10种不同的耐药基因，耐药基因TetA、TetB、floR、ermA、lnu(C)检出率较高，检出率41.2%～85.3%，耐药基因TEM、SHV、DHA、gyrA、gyrB检出率11.8%～13.7%，耐药基因OXA、ermB、qnrA、qnrB未检出(表3)。

3 讨论

副猪嗜血杆菌是一种条件致病菌，当外界环境改变时可导致猪的抵抗力降低，可以诱发感染其他病原菌。该菌主要通过飞沫、空气、直接接触及排泄物等多种途径传播，引起猪呼吸道疾病，严重者直接引起患猪死亡，是临床中常见的危害养猪业的主要病原菌之一[11-12]。

表2副猪嗜血杆菌分离株多重耐药结果

表3副猪嗜血杆菌分离株耐药基因检测结果

副猪嗜血杆菌具有多种血清型，不同血清型缺乏完全交叉免疫性，由于目前没有有效疫苗预防副猪嗜血杆菌，抗生素成为防治该病的主要手段之一，随着抗生素的使用，逐渐产生很强的耐药性[13]。本试验从安阳地区分离的102株副猪嗜血杆菌对青霉素、阿莫西林、庆大霉素等10种的耐药率44.1%以上，其他药物的耐药率为9.8%～26.5%，耐11、10、9种药物菌株最多，分别占分离菌株的17.6%、21.6%、20.6%。说明从安阳地区分离的副猪嗜血杆菌对常用的抗菌药产生很强的耐药性，且呈现多重耐药性。魏海林[6]报道了从四川地区分离的副猪嗜血杆菌对常用药物耐药情况严重，92.95%菌株至少对2种抗菌药物耐药。余仁等[4]报道的湖南地区分离副猪嗜血杆菌对阿莫西林和林肯霉素的耐药较强。从屠宰场中分离的3株副猪嗜血杆菌对青霉素、林可霉素和甲氧苄啶等抗菌药物耐药[8]。与本试验与上述报道的具有一定差异性，可能与地区和抗生素使用情况有关。在发生该病时应该合理使用抗菌药物，减少耐药性产生，提高治疗效果。

副猪嗜血杆菌耐药性的产生不仅与使用抗菌药物的频率有关，还有携带的耐药基因有关，在外界抗生素选择的压力下，其耐药机制发生改变引起耐药性，耐药基因是作为细菌产生耐药性的重要影响因素之一[8-11]。本试验表明，分离的102株副猪嗜血杆菌耐药基因TetA、TetB、floR、ermA、lnu(C)检出率41.2%～85.3%，其他耐药基因检出率11.8%～13.7%，说明分离菌株携带多种耐药基因。携带的耐药基因介导副猪嗜血杆菌耐药性机理尚未明确，有待进一步研究。本研究结果可为该地区的副猪嗜血杆菌病的防控提供科学依据。