五味子哮喘汤对哮喘小鼠SIRT1/Akt信号通路及肺功能的影响*

孙 毅， 任亚平， 孔 乔， 陈 辉△

（1滕州市中心人民医院药剂科，山东滕州277599；2北京中医药大学东直门医院中医科，北京100029）

支气管哮喘简称哮喘，是一种常见呼吸系统慢性炎症性疾病，患者主要表现为咳嗽、喘息和气促等症状，若不及时干预，可引起肺气肿等严重并发症，目前传统治疗药物仍不能有效控制重度哮喘患者症状，因此寻找治疗哮喘的新型药物至关重要[1]。近来研究显示，中医药在治疗哮喘中逐渐彰显出独特优势[2-4]。五味子哮喘汤（Schisandrae-asthma decoction，SAD）涉及五味子、麻黄（蜜炙）、干姜等十四味中药，为本院正常使用的中药饮片，产地地道，疗效确切，毒副作用小，价格低廉，使用安全。沉默信息调节因子2 相关酶1（silent information regulation 2 homolog-1，SIRT1）是一种烟碱胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）依赖的脱乙酰酶，广泛存在于动物细胞中，与细胞周期控制、炎症反应、氧化应激及细胞凋亡等密切相关；有研究显示，SIRT1 可作为一种抗炎因子，在哮喘炎症进展中发挥重要调节作用[5-6]。SIRT1 过表达可引起蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/Akt）磷酸化水平升高，与细胞增殖、凋亡及氧化应激等有关[7]。因此，本项工作拟探讨五味子哮喘汤对哮喘小鼠肺功能及SIRT1/Akt 信号通路的影响，以期揭示其作用机制，进一步为临床应用提供实验基础。

材料和方法

1 实验动物

120 只6 周龄清洁级雌性BALB/c 小鼠，体质量18～22 g，由中国科学院上海药物研究所提供，生产许可证号为SCXK（沪）2018-0002。于本院实验动物中心饲养，室温（23±1）℃，空气湿度50%～60%，黑暗光照交替时间12 h，自由饮水、采食。本研究经过本院动物伦理委员会批准通过。

2 药物、试剂及仪器

五味子哮喘汤配方：五味子6 g，麻黄（蜜炙）12 g，干姜6 g，款冬花（蜜炙）12 g，紫菀（蜜炙）12 g，胆南星6 g，地龙10 g，金银花12 g，芦根12 g，竹茹10 g，射干10 g，茯苓10 g，西洋参6 g，甘草6 g。药液制备：将中药加水浸泡40 min，煎煮两次，第1 次煎沸后再煎30 min，过滤；第2 次煎沸后再煎20 min，过滤（亦可用自动煎药机设定时间一次煎出药液）。合并两次煎液浓缩至400 mL 即得。生理盐水配制浓度为1 kg/L，备用。地塞米松（dexamethasone，Dex；货号：50-02-2）购自上海一飞生物科技有限公司；Trizol（货号：R0016）购自上海碧云天公司；PrimeScript ™RT reagent Kit（Perfect Real Time）和TB Green®Premix Ex Taq™Ⅱ（Tli RNaseH Plus）均购自TaKaRa（货号：RR037A 和RR820A）；兔源Ⅰ抗[抗SIRT1 抗体（货号：ab32441）、抗磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）抗体（货号：ab32089）、抗 磷 酸 化PI3K（phosphorylated PI3K，p-PI3K）抗体（货号：ab191606）、抗Akt 抗体（货号：ab32505）、抗磷酸化Akt（phosphorylated Akt，p-Akt）抗体（货号：ab38449）和抗GAPDH 抗体（货号：ab9485）]和Ⅱ抗羊抗兔IgG（货号：ab6721）均购自Abcam；WooⅠ型超声雾化吸入器购自上海塔望智能科技有限公司；Evolution 220 紫外分光光度计、ABI 7500 RT-qPCR 仪和FC 型酶标仪均购自Thermo。

3 方法

3.1 分组、模型制备及给药 小鼠适应性饲养1 周后随机分为对照（control）组、模型（model）组、阳性对照Dex 组、低剂量SAD（low-dose SAD）组、中剂量SAD（middle-dose SAD）组和高剂量SAD（high-dose SAD）组，每组20 只，其中10 只用于检测肺功能，另10 只取肺组织进行病理学观察、mRNA 及蛋白检测。参照文献[8]构建动物模型，除control 组外其余5 组于实验第1 和8 天皮下注射10 mg 卵清蛋白（ovalbumin，OVA）+200 mg 氢氧化铝[Al（OH）3]混合液，于第15天雾化吸入2%OVA 磷酸盐缓冲液进行过敏激发，每天1 次，每次30 min，持续1 周。造模成功标准：小鼠烦躁不安，弓背，呼吸加深、加快，严重者甚至伸颈、喘息状、大小便失禁等。对control 组予以等量生理盐水注射及雾化吸入。于第16 天给药处理：Dex 组灌胃Dex（10 mg/kg）；参考文献[9]及预实验结果（中剂量为70 kg 成人每日服用药物剂量与小鼠表面积换算比值），确定low-dose SAD 组、middle-dose SAD 组和high-dose SAD 组分别予以8.5 g/kg（8.5 mL/kg）、17 g/kg（17 mL/kg）和34 g/kg（34 mL/kg）SAD 灌胃；control 组和model 组灌胃等量双蒸水，均每天1次，连续7 d。

3.2 肺功能仪检测小鼠肺功能变化 末次给药后24 h，以2%戊巴比妥纳0.2 mL 腹腔麻醉各组小鼠，每组取10 只进行肺功能检测，将小鼠气管切开，置入气管插管并固定，按要求连接肺功能仪，记录小鼠0.1 s 用力呼气容积（forced expiratory volume in 0.1 s，FEV0.1）及最高呼气流速（peak expiratory flow rate，PEFR）等指标。

3.3 HE 染色观察肺组织病理学变化 小鼠麻醉处死后，取左肺组织，用4%多聚甲醛固定48 h，常规脱水、石蜡包埋后以0.4 mm 切片，脱蜡、水化后进行HE染色，于显微镜下观察肺组织病理学变化。

3.4 RT-qPCR 检 测 肺 组 织SIRT1、PI3K 和Akt 的mRNA 表达水平 Trizol 法提取各组小鼠部分右肺组织总RNA，反转录得到cDNA，置于-20℃保存备用。采用RT-qPCR 扩增SIRT1、PI3K及Akt mRNA 片段。反应体系（20 μL）：TB Green Premix Ex Taq Ⅱ（2×）10 μL，ROX Reference Dye II（50×）0.4 μL，cDNA（50 μmol/L）2 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.8 μL，ddH2O 6.0 μL。反应条件为：95℃30 s；95℃5 s，61℃34 s，40 个循环。采用2-ΔΔCt法定量分析肺组织SIRT1、PI3K 及Akt 的mRNA 相对表达水平。所用引物序列见表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1. The sequences of the primers for RT-qPCR

3.5 Western blot 检测肺组织SIRT1、PI3K、p-PI3K、Akt 和p-Akt 蛋白水平 采用Western blot 检测小鼠肺组织SIRT1、PI3K、p-PI3K、Akt 及p-Akt 蛋白水平。蛋白提取试剂盒提取各组小鼠肺组织总蛋白；BCA法测定蛋白质浓度；进行SDS-PAGE 分离，并转膜、封闭，分别添加SIRT1（1∶2 000）、PI3K（1∶1 000）、p-PI3K（1∶2 000）、Akt（1∶500）、p-Akt（1∶1 000）和GAPDH（1∶2 000）抗体，4℃孵育过夜，添加Ⅱ抗羊抗兔IgG（1∶5 000）室温避光孵育1 h，增强化学法显影，蛋白条带灰度值用ImageJ软件分析。

4 统计学处理

采用SPSS 19.0 软件进行统计学分析。所有数据采用平均数±标准差（mean±SD）表示。多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），两两间比较采用SNK-q检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

结果

1 五味子哮喘汤对小鼠肺功能的影响

与control 组比较，model 组小鼠肺功能指标FEV0.1 和PEFR 水 平 均显 著 降 低（P＜0.05）；与model 组比较，Dex 组、low-dose SAD 组、middle-dose SAD 组和high-dose SAD 组小鼠肺功能指标FEV0.1和PEFR水平均显著增加（P＜0.05），见图1。

Figure 1. Effect of Schisandrae-asthma decoction （SAD） on lung function in mice. Mean±SD. n=10. *P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs model group.图1 五味子哮喘汤对小鼠肺功能的影响

2 五味子哮喘汤对小鼠肺组织病变的影响

HE 染色结果显示，control组小鼠肺泡组织形态正常，无炎症细胞浸润；model 组小鼠肺壁增厚，肺组织周围可见大量炎症细胞浸润；Dex 组、low-dose SAD 组、middle-dose SAD 组和high-dose SAD 组小鼠肺组织病变呈不同程度减轻，见图2。

Figure 2. Effect of Schisandrae-asthma decoction （SAD） on lung lesions in mice（HE staining，scale bar=50 μm）. A：control group；B：model group；C：Dex group；D：low-dose SAD group；E：middle-dose SAD group；F：high-dose SAD group.图2 五味子哮喘汤对小鼠肺组织病变的影响

3 五味子哮喘汤对小鼠肺组织SIRT1、PI3K 和Akt mRNA表达的影响

与control 组比较，model 组小鼠肺组织SIRT1 mRNA 表达水平显著降低（P＜0.05），而PI3K 和Akt mRNA 表达水平显著升高（P＜0.05）；与model 组比较，Dex 组、low-dose SAD 组、middle-dose SAD 组和high-dose SAD 组小鼠肺组织SIRT1 mRNA 表达水平均显著升高（P＜0.05），而PI3K 和Akt mRNA 表达水平均显著降低（P＜0.05），见图3。

Figure 3. Effect of Schisandra-asthma decoction （SAD） on mRNA expression of SIRT1，PI3K and Akt in lung tissue of mice. Mean±SD. n=10. *P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs model group.图3 五味子哮喘汤对小鼠肺组织SIRT1、PI3K 和Akt mRNA表达的影响

4 五味子哮喘汤对小鼠肺组织SIRT1、PI3K、p-PI3K、Akt和p-Akt蛋白水平的影响

与control 组比较，model 组小鼠肺组织SIRT1 蛋白表达水平显著降低（P＜0.05），p-PI3K/PI3K 和p-Akt/Akt 蛋白水平显著升高（P＜0.05）；与model 组比较，Dex 组、low-dose SAD 组、middle-dose SAD 组和high-dose SAD 组小鼠肺组织SIRT1 蛋白表达水平均显著升高（P＜0.05），p-PI3K/PI3K 和p-Akt/Akt 蛋白水平显著降低（P＜0.05），见图4。

Figure 4. Effect of Schisandra-asthma decoction（SAD）on protein levels of SIRT1，PI3K，p-PI3K，Akt and p-Akt in lung tissue of mice. Mean±SD. n=10. *P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs model group.图4 五味子哮喘汤对小鼠肺组织SIRT1、PI3K、p-PI3K、Akt及p-Akt蛋白表达的影响

讨论

本研究采用OVA 配合免疫佐剂Al（OH）3制备哮喘模型，结果显示，与control组比较，model组小鼠肺功能指标FEV0.1 和PEFR 均显著降低，肺组织结构破坏严重，炎症细胞浸润明显，与Mäkinen 等[10]和Song 等[11]的结果一致，提示哮喘模型小鼠制备成功。五味子哮喘汤由五味子、麻黄、干姜、款冬花、紫菀等十四味中药组成，其中主药五味子具有敛肺、滋肾、收汗、治肺虚咳喘、益气强阴之功效[12-13]；麻黄可疏解肌表、发汗，还能化痰止咳、滋阴敛肺、运水祛湿，常用于伤风感冒、咳嗽气喘、风湿痹痛及阴疽、咳痰等病症[14]；干姜则有温中散寒、回阳通脉、温肺化饮之功效；款冬花、紫菀和胆南星具有润肺下气、清热化痰止咳之功效[15]。有研究报道，五味子及其衍生物对哮喘具有较好的治疗效果，但其具体作用机制尚不完全明了[16]。本研究结果显示，哮喘小鼠经五味子哮喘汤治疗后，肺功能及肺组织病理病变改善显著，且高剂量治疗效果优于阳性药物地塞米松，提示五味子哮喘汤可改善哮喘小鼠肺功能，对哮喘具有一定治疗作用，其作用机制进行进一步研究。

哮喘以气道重塑及慢性炎症为主要病理特征，其中气道平滑肌过度增殖及凋亡不足是引起气管重塑、难治性哮喘的重要原因[17]。SIRT1可通过调控核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、p38 丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）及PI3K/Akt 通路，抑制氧化应激反应、炎症反应及细胞增殖凋亡过程，在哮喘中亦发挥重要作用[18-21]。刘楠等[22]的研究表明，SIRT1可通过Akt通路调节IL-6水平，影响哮喘患者肺功能。Akt磷酸化是PI3K/Akt通路发挥抗凋亡作用的关键因子，在肺部生理和病理过程中发挥重要作用。本研究结果显示，与模型组比较，五味子哮喘汤增加SIRT1 mRNA 及蛋白表达，降 低PI3K 和Akt mRNA 及p-PI3K/PI3K 和p-Akt/Akt蛋白水平，与孟芝等[23]的研究结果一致，提示五味子哮喘汤可能通过SIRT1/Akt 信号通路，提高FEV0.1和PEFR水平，从而改善肺功能。

综上所述，五味子哮喘汤可改善哮喘小鼠肺功能，减轻哮喘症状，可能与调控SIRT1/Akt 信号通路有关。但其具体机制及下游调控炎症信号通路还是其他信号通路，有待进一步深入探究。