青藤碱调控CUMS抑郁大鼠突触可塑性及其对Notch和mTOR信号通路的影响*

王志坚， 王晓敏， 刘胜兵， 郭燕君， 潘巍巍， 沈忠飞

（嘉兴学院医学院，浙江嘉兴314000）

抑郁症是一种多因素导致的复杂的精神疾病，主要表现为思维认知障碍、情绪低迷和自杀倾向等，全球约11%的人患有抑郁症，给患者、家人和社会造成了巨大的精神和经济负担，严重阻碍了社会的发展。大量研究表明，抑郁症是一种炎症性疾病[1]，炎症因子在抑郁症的发病进程中起到重要作用，已成为抑郁症的重要治疗靶点和研究热点。近年来，国家大力支持中医药发展，尤其是在此次新冠肺炎疫情的预防和治疗中，中医药表现出良好的效果，开发新的中医药抗抑郁药物是一项响应国家号召的紧迫任务。

青藤碱（sinomenine，Sin），是一种来源于中草药防己科植物青藤的生物碱，临床上广泛用于系膜增生性肾炎和类风湿性关节炎治疗[2]，另外Sin 还有抗肿瘤、细胞保护、免疫抑制和抗炎作用[3]。近年来研究表明，Sin 对神经疾病具有一定的作用，可通过提高脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）的表达缓解抑郁症状[4]，亦能通过抑制神经炎症减轻大鼠脑缺血再灌注损伤[5]，但其对抑郁症炎症反应影响的研究比较少。

本实验室前期研究显示，30、50 和100 mg·kg-1·d-1的Sin 均能够缓解慢性不可预见性温和应激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）抑郁大鼠的抑郁症状，减轻炎症反应，且在30 mg·kg-1·d-1的低剂量灌胃处理就有着较好的效果，但对突触可塑性、细胞凋亡、Notch 信号通路、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信号通路等的影响尚不明确。本研究旨在探讨Sin 对CUMS抑郁大鼠突触可塑性的影响及可能的分子机制。

材料和方法

1 材料

1.1 动物 健康雄性清洁级7 周龄SD 大鼠120 只，体重180～210 g，从浙江大学实验动物中心购买，许可证号为SYXK（浙）2018-0016。

1.2 试剂和主要仪器 兔抗Bcl-2、cleaved caspase-3（C-C3）、β-actin、BDNF、Notch1、Hes1、Jagged1、mTOR、磷 酸 化mTOR（phosphorylated mTOR，pmTOR）、真核细胞翻译起始因子4E 结合蛋白1（eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein 1，4EBP1）和磷酸化4EBP1（phosphorylated 4EBP1，p-4EBP1）抗体及山羊抗兔Ⅱ抗（Cell Signaling Technology）；氟西汀（fluoxetine，Fluo；礼来制药有限公司）；Sin（Sigma）；高尔基染色试剂盒（FD Neuro Technologies）。荧光定量PCR 仪（AFD4800）；凝胶电泳仪（Bio-Rad）；动物行为自动跟踪系统EthoVision 3.0（Noldus）；其他试剂来自碧云天生物技术有限公司。

2 方法

2.1 分组和建模 大鼠适应性饲养1 周后，随机分为对照（control，Ctrl）组、CUMS 组、Fluo 组和Sin 组（n=30），均单笼饲养。饲养环境：12 h 光照/12 h 黑暗（光照时间：早7 点到晚7 点），湿度（55±5）%，温度（22±2）℃，自由进食进水。对照组正常饲养，其余3组采用孤养法并结合CUMS 建立CUMS 抑郁模型[6]，按表1，每天给予一种刺激，其中连续2 天的刺激不相同，合计刺激28 d。

2.2 给药 连续刺激2 周后，将Fluo 和Sin 溶于生理盐水中，开始对Fluo 组和Sin 组大鼠分别给予Fluo（20 mg·kg-1·d-1）[6]和Sin（30 mg·kg-1·d-1）[5]灌胃治疗，Ctrl 组和CUMS 组均灌胃相同体积的生理盐水。连续灌胃2周时间。

2.3 行为学测试 （1）体重：建模结束后分别称量各组大鼠体重，记录并制作柱状图。（2）糖水测试：建模结束后，事先给与各组大鼠2 瓶1%糖水，进行适应训练；禁水12 h 后，准备2 瓶水，重量相同，分别编号A 和B，A 为1%糖水，B 为平时喝的水，1 h 后称量记录A 和B 重量。糖水偏好（%）=A 减少克数/（A+B减少克数）×100%。（3）旷场实验：建模后，根据旷场实验步骤[7]，记录分析各组大鼠在格子里面的移动总距离和中央活动时间，每只大鼠测试前均应清理干净旷场区域，以免产生干扰。（4）强迫游泳：参照文献进行[5]，记录大鼠游泳6 min 中后4 min 的不动时间，即头部不能进入水中，直立姿势漂浮的时间。

表1 温和刺激名称及刺激时间Table 1. The name of each mild stimulus and stimulating time

2.4 RNA 提取及qPCR 大鼠麻醉后迅速断头取脑，冰上拨出海马组织，液氮中研磨并加入Trizol 试剂，按照说明书步骤提取组织中的总RNA。计算RNA 浓度并用Fermentas 试剂盒反转录成cDNA，再进行qPCR[7]，并根据2-ΔΔCt计算出各目的基因的相对表达量。引物序列见表2。

表2 引物序列Table 2. Sequences of the primers

2.5 蛋白质提取及Western blot 参照文献[6]，大鼠麻醉后断头取脑，迅速分离海马组织后放-80℃冰箱备用。冰箱取出后加入液氮和裂解液，于研钵中研磨裂解，经4℃离心，取上清液测定蛋白浓度（BCA 试剂盒），定量后煮沸变性，配胶上样（30 μg总蛋白）进行SDS-PAGE，转膜至PVDF 膜上，用5%的脱脂奶粉封闭1 h 后，4℃冰箱过夜孵育Ⅰ抗（BDNF、Notch1、Hes1、Jagged1、Bcl-2、C-C3、p-mTOR、mTOR、p-4EBP1、4EBP1 和β-actin），用PBST 缓冲液洗涤各条带（每次5 min，共3 次），室温孵育Ⅱ抗2 h，用PBST缓冲液洗涤各条带（每次5 min/次，共3 次），加入发光剂显影定影，条带扫描后用ImageJ 测算目的蛋白的灰度值[8]。

2.7 高尔基染色 10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉大鼠后，迅速处死取脑，经PBS 缓冲液洗涤后放入等体积的A 液和B 液混合液中，6 h 后更换一次新鲜的A液B 液混合液，连续浸泡14 d 后，取出脑组织放入C液（避光），24 h 后更换新鲜C 液并在4℃冰箱避光保存3 d。冰箱取出脑组织沉入甘油（15%）和蔗糖（20%）混合液中24 h，用冰冻切片机进行常规切片（100 μm），贴在载玻片上，经过不同梯度（50%、75%、95%和100%）的乙醇脱水和二甲苯透明后，用中性树胶封片，显微镜下观察，选择典型CA1区神经元并拍照，用ImageJ 软件分析由胞体发出的树突上第一个树突分支，即二级树突上（长度30～60 μm）的树突棘数量，计算10 μm 的平均树突棘数量，即得到树突棘密度[8]。

2.8 苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色 将大鼠麻醉处死，取出脑组织进行固定透明并石蜡包埋，在石蜡切片机上切片后经过二甲苯和不同浓度的乙醇进行脱蜡，进行常规HE 染色，然后再经过不同浓度的乙醇脱水和二甲苯透明后，用中性树胶封片，于显微镜下观察[8]。

2.9 ELISA 实验 取各组大鼠海马部称重匀浆离心取上清液，按照ELISA 试剂盒（碧云天）步骤检测海马中白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的含量[5]，单位为μg/（g tissue）。

3 统计学处理

应用GraghPad Prism 8 和SPSS 17 统计学软件分析数据。数据以均数±标准差（mean±SD）表示。多组之间采用单因素方差分析，用SNK-q检验进行两两比较。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1 Sin作用后体重、糖水偏好和行为学指标的变化

如图1 所示，与Ctrl 组相比，CUMS 组大鼠体重和旷场实验中央不动时间显著减少，糖水偏好和旷场实验总距离显著下降，强迫游泳不动时间显著增加；而Sin作用后，体重、移动总距离和中间停留时间均显著增加，强迫游泳中的不动时间显著降低，糖水偏好显著增加（P＜0.05）。

Figure 1. The changes of body weight，sucrose preference and behavioral indicators in the 4 groups. A：body weight；B：sucrose preference；C：total distance；D：open-field test；E：forced swimming. Mean±SD. n=30. *P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs CUMS group.图1 4组大鼠之间体重、糖水摄取及行为学指标的变化

2 Sin 作用后海马结构完整，树突棘密度升高，突触相关蛋白表达上调

与Ctrl 组相比，CUMS 组海马区细胞排列紊乱，细胞间隙增大，多数细胞变性萎缩（图2A）；树突棘密度下降（P＜0.05），见图2B；突触重塑相关蛋白BDNF 在蛋白和mRNA 水平均显著下调（P＜0.05），见图2C、D。Sin 作用后，海马区细胞形态为圆形较规则，细胞核清晰（图2A）；树突棘密度显著升高（P＜0.05），见图2B；BDNF 表达在蛋白和mRNA 水平均显著上调（P＜0.05），见图2C、D。

3 Sin 作用后海马Notch 信号通路相关蛋白表达上调

Western blot 结果显示，与Ctrl 组相比，CUMS 组Notch1、Hes1和Jagged1表达显著下调（P＜0.05）；Sin作用后，Notch1、Hes1 和Jagged1 表达显著上调（P＜0.05），见图3A。qPCR 结果与Western 结果一致，见图3B。

4 Sin作用后海马Bcl-2表达上调，C-C3表达下调

如图4 所示，与Ctrl 组相比，CUMS 组抗凋亡蛋白Bcl-2表达显著下调（P＜0.05），凋亡蛋白caspase-3活化形式C-C3 表达显著上调（P＜0.05）；Sin 作用后，Bcl-2表达显著上调（P＜0.05），C-C3表达显著下调（P＜0.05）。我们同时用qPCR 检测Bcl-2 和caspase-3 的mRNA 水 平，结 果 与Western blot 结 果一致。

5 Sin 作用后海马mTOR 信号通路相关蛋白表达上调

如图5 所示，与Ctrl 组相比，CUMS 组mTOR 和下游靶基因4EBP1磷酸化水平显著降低；Sin处理后p-mTOR和p-4EBP1均显著上调（P＜0.05）。

6 Sin作用后海马炎症反应降低

ELISA 结果显示，与Ctrl 组相比，CUMS 组大鼠海 马 组 织中IL-1β、IL-6 和TNF-α 显 著 上 调（P＜0.05）；Sin 处理后，IL-1β 和TNF-α 显著下调（P＜0.05），而IL-6无显著变化（P＞0.05），见图6。

讨论

抑郁症严重影响患者的健康和生活质量，成为一个不可忽视的社会问题。CUMS法建立抑郁模型，能够有效模拟抑郁症状且症状稳定，被广泛用于抑郁症治疗相关研究。根据文献建立CUMS 模型[6，9]，建模28 d 后，CUMS 组体重、糖水偏好、旷场实验总距离和中间停留时间均显著降低，强迫游泳不动时间明显增加，这与文献结果一致，说明抑郁模型建立是成功的。Sin 灌胃处理后，上述抑郁症状均明显减轻，说明Sin 具有一定的抗抑郁作用，可能是潜在的治疗抑郁症的药物。

Figure 2. The changes of hippocampal structure，dendritic spine density and BDNF expression in Sin-treated CUMS rats. A：HE staining of hippocampal structure（scale bar=100 μm）；B：Golgi staining of secondary dendrites and dendritic spines（scale bar=20 μm）；C，D：the expression of BDNF at protein and mRNA levels. Mean±SD，n=3. *P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs CUMS group.图2 Sin作用后大鼠海马结构、树突棘密度和突触重塑相关蛋白BDNF的变化

Figure 3. The changes of Notch signaling proteins Notch1，Hes1 and Jagged1 in Sin-treated CUMS rats. A：Western blot results；B：qPCR results. Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs CUMS group.图3 Sin作用后Notch信号通路蛋白Notch1、Hes1和Jagged1表达的变化

Figure 4. The changes of apoptosis-related proteins Bcl-2 and cleaved caspase-3（C-C3）in Sin-treated CUMS rats. A：Western blot results；B：qPCR results. Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs CUMS group.图4 Sin作用后细胞凋亡相关蛋白Bcl-2和C-C3的变化

Figure 5. The phosphorylation levels of mTOR and 4EBP1 in Sin-treated CUMS rats. Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs CUMS group.图5 Sin作用后mTOR和4EBP1磷酸化水平的变化

Figure 6. The changes of IL-1β，IL-6 and TNF-α in Sin-treated CUMS rats. Mean±SD. n=6. *P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs CUMS group.图6 Sin作用后炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的变化

近年研究表明，抑郁症发病与海马突触重塑性的改变紧密关联。抑郁发生后，海马突触重塑相关基因表达下调，伴随神经元的萎缩以及突触结构和功能的改变，而氟西汀等抗抑药物治疗后海马突触可塑性得到明显改善[10]。重度抑郁患者海马区椎体细胞体积变小，并伴随突触蛋白表达下调。突触重塑包括结构和功能重塑，海马神经元结构完整性、树突棘密度的改变直接影响着树突的功能[11]。此外，神经营养因子维持神经元生存、生长和微环境，并参与大脑学习和记忆[12]，对突触重塑起着重要的调节作用，其中最重要的营养因子是BDNF，在海马和大脑皮层等丰富表达[13]，抑郁发生时，BDNF表达减少，甚至发生基因缺陷，无法正常表达。长时程增强（long-term potentiation，LTP）是重要的功能突触可塑性，必须依赖BDNF 才能实现，因此BDNF 是重要的突触可塑性相关蛋白[20]。本实验中Sin处理后，抑郁大鼠海马区细胞形态为圆形较规则，细胞核清晰，树突棘密度显著升高，BDNF 表达在蛋白和mRNA 水平均显著上调，说明Sin 作用后海马突触可塑性明显上调。

Notch 信号通路进化上十分保守，主要由受体、配体和下游靶分子等组成，Notch1、Jagged1 和Hes1分别是重要的受体、配体和下游靶分子，在脑内尤其海马组织中高表达。有研究表明，糖氧剥夺和脑缺血后，大鼠体内Notch 信号通路被激活，体内阻断Notch 通路，脑部多巴胺神经元减少，多巴胺分泌骤减直接引起一系列精神病症状，与脑缺血损伤、阿尔兹海默症和抑郁等多种神经疾病发生有关[14]。Notch 信号通路在突触重塑、学习、记忆的调控中具有非常重要的作用[15]。本研究中，Sin 处理后，抑郁大鼠海马组织Notch1、Jagged1 和Hes1 表达均上调，Notch信号通路被激活，Sin可能通过激活Notch信号通路蛋白的表达改善海马突触可塑性。

抑郁发生时伴随着较高的凋亡水平，5-HT 再摄取抑制剂氟西汀，通过上调突触体多唾液酸神经细胞粘附分子的表达调节突触可塑性，且凋亡水平显著下调[16]；柴胡皂苷也通过降低海马细胞凋亡水平缓解大鼠抑郁症状[17]。这说明细胞凋亡是重要的致病因素和治疗靶点。本实验中Sin作用后，抑郁大鼠抗凋亡蛋白Bcl-2 表达上调，C-C3 表达下调，说明凋亡水平显著降低，Sin可能通过抑制细胞凋亡缓解大鼠抑郁症状。

研究表明，mTOR 通过磷化下游靶分子4EBP1调控海马部突触重塑相关蛋白的表达，与突触可塑性的调节密切相关，如内稳态突触可塑性的调控依赖mTOR 信号通路[18]，在大鼠内嗅-海马通路中调节疼痛相关突触可塑性[19]。抗抑郁药物如氟西汀等通过上调p-mTOR 和p-4EBP1 调控CUMS 突触重塑相关蛋白的表达[6]。本实验中Sin 处理后，抑郁大鼠pmTOR 和p-4EBP1 均上调，mTOR 信号通路被激活，Sin 可能通过激活mTOR 信号通路调控海马突触重塑。

研究表明，炎症因子如IL-6、IL-1β 和TNF-α 参与抑郁的病理发生过程[20]，抗抑郁药作用后，抑郁症患者血清中炎症因子恢复正常水平。炎症因子通过激活相关信号通路，维持正常的突触可塑性以及神经代谢，最终影响情绪调节[21]。本实验中Sin 处理后，抑郁大鼠炎性因子IL-6、IL-1β 和TNF-α 水平显著下调，炎症反应明显降低，Sin 可能通过降低炎性反应缓解抑郁症状，改善突触可塑性。

综上所述，Sin 作用后，抑郁大鼠海马区炎症反应降低，细胞凋亡信号通路被抑制，海马结构破坏较小，与突触重塑相关的Notch 和mTOR 通路被激活，突触重塑相关蛋白BDNF 表达上调，突触结构和突触可塑性明显改善，抑郁症状缓解。因此，Sin 调控CUMS 大鼠海马神经突触可塑性，可能与Notch 和mTOR通路的激活有关。