金雀异黄酮对创伤后应激障碍大鼠海马组织5-HT水平和神经元自噬的调节作用*

2021-04-06洪嘉晨胡晶晶练雷栋邱新宇倪桂莲胡伟玲汪旭明吴仲敏

中国病理生理杂志 2021年3期

范勇，洪嘉晨，胡晶晶，练雷栋，邱新宇，倪桂莲，胡伟玲，汪旭明，吴仲敏△

（1台州学院临床医学院，浙江台州318000；2临海市第一人民医院神经内科，浙江临海317000；3台州学院基础医学院，浙江台州318000）

创伤后应激障碍（post-traumatic stress disorder，PTSD）是指患者在遭受强烈的、超过个体所能承受的灾难性创伤事件后，延迟出现的、长期性的精神心理综合征[1]。患者常伴有抑郁、焦虑、睡眠障碍等身心障碍症状，严重者有自杀倾向[2]。近年来，随着重大传染病、战争及突发事件的不断出现，PTSD 的患病率呈现明显上升趋势[3]。PTSD 是应激相关的障碍，表现为中枢神经系统对应激信息的记忆障碍，使条件化的恐惧反应难于抑制或消退。海马与PTSD有密切关系，研究显示，海马组织神经递质失衡尤其是5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）能神经功能低下是构成PTSD的病理生理基础之一[4]，PTSD患者的海马体积缩小，海马功能紊乱，海马皮质代谢受到明显抑制，海马神经元存在异常自噬现象[5]，提示海马组织5-HT 水平不足和海马神经元异常自噬可能参与PTSD 的发病进程，但其具体发病机制尚未明确。金雀异黄酮（genistein，Gen）是一种来源于大豆的天然异黄酮，具有弱雌激素样作用及神经保护功能。近来有研究报道Gen 通过调节抑郁相关脑区5-HT 含量而产生抗抑郁效应[6-7]，但其对PTSD 是否有干预作用，鲜见文献报道。本研究采用连续单一应激和足底电击相结合的方法建立PTSD 大鼠模型[8]，观察Gen 对PTSD 大鼠海马组织5-HT 含量和海马神经元自噬的影响，探讨Gen 对大鼠PTSD 的干预作用及其机制。

材料和方法

1 实验药物、试剂及仪器

行为学自动观察分析系统由上海吉量软件科技有限公司提供，含摄像监控、计算机及Super Maze 分析软件。Gen 购自安徽酷尔生物工程有限公司；盐酸氟西汀分散片（本实验中阳性对照药），每片含氟西汀（fluoxetine，FLX）20 mg，购自西班牙礼来公司；兔抗LC3 抗体购自CST；兔抗beclin 1 抗体和山羊抗兔IgG-FITC 荧光Ⅱ抗购自ABclonal；兔抗GAPDH 抗体和山羊抗兔IgG-HRP Ⅱ抗购自Biosharp；RIPA 裂解液和BCA 试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；免疫印迹相关试剂购自北京索莱宝科技有限公司；ELISA检测试剂盒购自Elabscience。

2 实验动物及分组

健康6 周龄SPF 级雄性SD 大鼠，体重（200±20）g，由浙江省医学科学院提供，动物的合格证编号为SCXK（浙）2019-0002；大鼠进行7 d 的适应性饲养后，通过旷场实验剔除垂直和水平活动总分低于10者（即初始运动能力较差的大鼠），而后用完全随机设计的方法，即将100 只旷场实验后合格的大鼠，随机分成5 组，即对照（control）组、PTSD 组、FLX 组、低剂量Gen（low-dose Gen，Gen-L）组和高剂量Gen（high-dose Gen，Gen-H）组，每组20只。

3 实验方法

3.1 PTSD 模型的建立及干预方法大鼠进行1 周的适应性饲养后，除对照组大鼠外，其余组的大鼠均采用连续单一应激和足底电击结合的方法建立PTSD 模型，即先进行单一连续应激：禁锢2 h、强迫游泳20 min、七氟烷麻醉至昏迷，在大鼠苏醒30 min后，把大鼠放于自制电击箱（40 cm×30 cm×25 cm）中，适应196 s 后给予15 个循环周期（电流0.8 mA，持续10 s，间歇10 s）的足底电击。将对照组大鼠放于无电流的相同电击箱中同样的时间，不给予足底电击。实验后将大鼠放回鼠笼静养。饲养条件：自由饮水摄食、昼夜节律、室温22～25℃。依据文献[5，9]在实验过程中每天上午9：00 给予低、高剂量Gen 组大鼠分别灌服7 和14 mg/kg Gen；阳性药物组大鼠灌服氟西汀，氟西汀的用药剂量为10 mg/kg，均溶于含0.5%羧甲基纤维素钠的生理盐水中；对照组及模型组每日给予等体积含0.5%羧甲基纤维素钠的生理盐水灌胃。各组灌胃容积均为5 mL/kg，分别于药物干预的第7天和第14天时测试实验效应。

3.2 行为学检测

3.2.1 旷场实验（open-field test）于药物干预的第7 和14 天时分别取各组大鼠进行旷场实验，实验过程需保持安静，使用特制的立方体旷场箱（80 cm×80 cm×40 cm），底面及内侧壁均为黑色，底面用线划分了16 格，每格形制均为20 cm×20 cm。位于中央的格为中央格（4个中心正方形），沿侧壁的格称为外周格（12 个周边正方形）。摄像头安置于正中格正上方。实验时动物放于箱内底面正中格中，并用自动观察分析系统摄像，观察大鼠在5 min 内的运动总路程、后肢直立次数（2前爪腾空或攀附墙壁，为垂直运动得分）、中央格穿越次数（4 爪均进入方格才记数，为水平运动得分），以上数据均是用于衡量大鼠探索行为能力的指标[5]。每只大鼠仅测定1 次。每一次在进行下一只观察前，均要彻底清洗箱底面及内壁并用乙醇除去上一只鼠的味道，避免前一只动物残留的信息（如动物的大、小便、气味）影响下次测试结果。

3.2.2 高架十字迷宫实验（elevated plus maze test）旷场实验结束后，对各组大鼠进行高架十字迷宫实验，实验在安静环境下进行。高架十字迷宫由一个开臂和一个闭臂呈十字交接而成，高出地面36 cm。开、闭臂均为46 cm 长，15 cm 宽，二臂交接区为15 cm×15 cm 大小的中心平台。实验开始时，大鼠可以自由活动5 min。并用进入开臂的时间百分比，进入开臂的次数百分比以及焦虑指数｛焦虑指数=1-[1/2（开臂时间/总时间）+1/2（进入开臂的次数/总的探索次数）]｝来衡量大鼠的焦虑程度[5]（大鼠4 爪均进入开臂才开始计时，若大鼠从开臂掉下，则此次实验数据作废）。

3.2.3 僵立行为测定高架十字迷宫实验结束后，测定各组大鼠的僵立行为，将大鼠放置于无电流的原造模电击箱中，检测4 min 内大鼠的僵立行为，每10 s 测一次，表现为僵立行为时为阳性，木僵率为阳性次数之和占总次数的百分比。僵立行为是在啮齿类动物中常见的一种防御行为，是大鼠恐惧表达的一种行为方式[5]。常常表现出刻板的蹲伏姿势，大鼠除呼吸运动以外其它的肌肉运动均消失，可以伴有轻微的摇摆。

3.3 海马组织Nissl 染色行为学测试结束后，随机抽取各组大鼠5 只，经腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，心腔内灌注生理盐水，后经4%多聚甲醛灌流固定，之后取完整大脑用4%多聚甲醛后固定24 h，石蜡包埋，常规脑组织切片（厚5 μm），切片分4 套，1套按尼氏染色步骤进行尼氏染色，光镜下观察海马神经元形态结构及数目改变，另3 套分别用于beclin 1和LC3免疫荧光标记染色和阴性对照。

3.4 海马组织beclin 1 和LC3 免疫荧光标记取上述切片3 套，依次入二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，柠檬酸钠抗原修复，3%过氧化氢浸泡10 min，羊血清封闭后，其中的2 套分别滴加兔抗beclin 1、LC3 Ⅰ抗，4℃孵育过夜；PBS 液漂洗3 min、3 次，FITC 荧光Ⅱ抗室温避光孵育2 h；PBS液漂洗3 min、3次，DAPI工作液室温避光孵育5 min；PBS 液漂洗3 min、3 次，滴加甘油PBS 混合液封片；激光共聚焦显微镜下观察beclin 1和LC3荧光标记的阳性神经元。第3套切片不加Ⅰ抗，用于阴性对照。

3.5 海马组织beclin 1 和LC3 蛋白水平检测行为学测试完毕后，随机抽取各组大鼠5 只，经腹腔注射10%水合氯醛（0.5 mL/kg）深麻醉，大鼠断头取新鲜海马组织，冰浴中分别抽提总蛋白，BCA 法测定蛋白浓度。制胶、电泳、转膜、封闭，加入目标蛋白Ⅰ抗（1∶1 000）或GAPDH Ⅰ抗（1∶2 000），4℃孵育过夜，TBST 洗膜，加入Ⅱ抗（1∶2 000），室温孵育1 h，TBST洗膜，加入ECL显色剂进行曝光。

3.6 海马组织5-HT 含量检测取上述大鼠新鲜海马组织，进行组织匀浆，吸取上清液。按5-HT ELISA检测试剂盒步骤要求进行5-HT含量的检测。

3.7 海马组织5-HT含量与beclin 1和LC3蛋白水平之间的相关性分析获取实验第7 天和第14 天时各组大鼠海马组织5-HT、beclin 1、LC3 蛋白数值，采用Pearson 相关分析分析海马组织5-HT 含量与海马beclin 1和LC3蛋白水平之间的相关性。

4 统计学处理

采用SPSS 软件22.0 进行统计学分析处理。所有数据以均数±标准差（mean±SD）表示。两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析或重复测量方差分析，进一步两两比较采用LSD 检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1 Gen减少大鼠的PTSD样行为

1.1 Gen 提升PTSD 大鼠的探索能力旷场实验结果显示，第7、14 天PTSD 组大鼠的运动总距离、直立次数和进入中央格次数均较对照组减少（P＜0.01），低、高剂量Gen 组大鼠上述各指标值均高于同时段PTSD 模型组（P＜0.01），且高剂量Gen 组效果优于低剂量Gen组和氟西汀组（P＜0.05），见表1。

表1 大鼠旷场实验结果比较Table 1. Comparison of the results of open-field test in rats（Mean±SD. n=10）

1.2 Gen 减少PTSD 大鼠的焦虑样行为高架十字迷宫实验结果显示，第7、14 天PTSD 组大鼠进入开臂次数百分比、进入开臂时间百分比较对照组减少（P＜0.01），而焦虑指数较对照组增加（P＜0.01），低、高剂量Gen 组大鼠进入开臂的次数和时间百分比均高于同时段PTSD 组，焦虑指数显著低于同时段PTSD 模型组（P＜0.05），高剂量组上述指标值优于低剂量组和氟西汀组（P＜0.05），见表2。

表2 大鼠高架十字迷宫实验结果比较Table 2. Comparison of the results of elevated plus-maze test in rats（Mean±SD. n=10）

1.3 Gen 减少PTSD 大鼠的恐惧样行为僵立实验结果显示，第7、14 天PTSD 组大鼠的木僵率较对照组上升（P＜0.01）。低、高剂量Gen 组木僵率均显著低于同时段PTSD 模型组（P＜0.01），其中高剂量Gen组木僵率低于低剂量Gen 组和氟西汀组（P＜0.01），见表3。

表3 大鼠僵立实验结果比较Table 3. Comparison of the results of stiff behavior test（numbness rate）in rats（%. Mean±SD. n=10）

2 Gen减轻PTSD大鼠海马神经元的病理改变

Nissl 染色结果显示，对照组大鼠海马神经元轮廓清晰，染色均匀，尼氏小体明显，核大而圆，核膜完整，排列整齐，神经元形态正常；同时段模型组大鼠海马神经元存在不同程度的萎缩，细胞外形不规则，数量减少，排列松散，核固缩现象明显；同时段低、高剂量Gen 组及氟西汀组神经元核固缩现象减少，神经元排列趋向整齐，见图1。

Figure 1. The distribution of hippocampal neurons in rats（Nissl staining，scale bar=50 μm）.图1 大鼠海马神经元的形态与分布

3 Gen 减少PTSD 大鼠海马组织beclin 1 和LC3 阳性神经元数量

免疫荧光标记结果显示，第7 和14 天对照组海马组织beclin 1 阳性细胞数为（3.20±1.92）mm-2和（1.60±1.14）mm-2，模型组为（50.20±5.26）mm-2和（31.20±6.37）mm-2，对照组LC3 阳性细胞数为（3.00±1.58）mm-2和（2.80±1.92）mm-2，模型组为（25.20±2.16）mm-2和（39.20±4.38）mm-2，PTSD 模型组beclin 1 和LC3 阳性神经元均显著多于对照组（P＜0.01）；低、高剂量Gen 组及氟西汀组beclin 1 和LC3 阳性神经元均少于同时段PTSD 模型组（P＜0.01），见图2。

4 Gen 降低PTSD 大鼠海马组织beclin 1 和LC3 蛋白水平

Western blot 结果显示，PTSD 模型组beclin 1 蛋白水平和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白比值均高于对照组（P＜0.01），低、高剂量Gen 组及氟西汀组beclin 1 蛋白水平和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白比值均低于模型组（P＜0.01），见图3、4。

5 Gen提高PTSD大鼠海马组织5-HT的含量

ELISA 结果显示，第7、14天PTSD 模型组海马组织5-HT 含量较对照组显著降低（P＜0.01）；低、高剂量Gen 组海马组织5-HT 含量显著高于同时段PTSD模型组（P＜0.01），且14 d 组高于7 d 组（P＜0.05），高剂量Gen 组在14 d 高于同时段氟西汀组（P＜0.05），见表4。

6 海马组织5-HT 含量与beclin 1 和LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白比值之间存在显著负相关

Pearson 相关性分析显示，各时段各组大鼠海马组织5-HT 含量与beclin 1 和LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白比值之间呈显著负相关，相关系数分别为r=-0.75 和r=-0.71（P＜0.01），见图5、6。

讨论

基于动物模型探究PTSD 发病机理和寻找药物治疗靶点是目前PTSD 研究的一大热点，本研究采用连续单一应激和足底电击相结合的方法建立PTSD大鼠模型，实验大鼠先后经历了禁锢、溺水、麻醉和电击4 种应激刺激，旷场实验、高价十字迷宫实验和僵立行为实验结果显示，模型组大鼠出现探索性行为的次数显著减少，焦虑、恐惧样行为表现显著增加，并出现逃避创伤相关环境等典型的PTSD 样精神和行为表现，说明该模型能较好地模拟PTSD 的发病环境，是研究PTSD 发病机制及寻求药物治疗靶点较为理想的动物模型。

Gen又称染料木素，是一种来源于大豆和红三叶草等植物的多酚类化合物，具有抗炎、抗抑郁、抗氧化和神经保护等功能，对心血管疾病、围绝经期抑郁、骨质疏松症、老年性痴呆等疾病有一定改善作用[10]。而Gen 是否具有抗PTSD 作用鲜见报道。本研究通过构建PTSD 大鼠模型，观察Gen 的抗PTSD作用，并探讨Gen 的抗PTSD 机制。行为学实验结果显示，与PTSD 模型组相比，低、高剂量Gen 组大鼠探究性行为显著增加，焦虑恐惧样行为显著减少，提示Gen 具有减少大鼠PTSD 样行为的效应，对PTSD 症状有明显调节作用。

研究显示，最初创伤记忆影响与PTSD 的神经生物学机制有关，包括海马、杏仁核、前额叶及下丘脑-垂体-肾上腺轴等结构和功能改变。海马是大脑边缘系统的重要组成部分，位于大脑、丘脑和内侧颞叶之间，是调节应激反应的重要部位，同时也是受应激影响最严重的脑区[11]。PTSD 患者海马体积缩小，海马神经元存在异常丢失或死亡等病理改变[12-13]。本研究观察到PTSD 大鼠海马神经元存在不同程度的萎缩，细胞外形不规则，数量减少，排列松散，核固缩现象明显；而低、高剂量Gen 组海马神经元核固缩现象减轻，神经元排列趋向整齐，提示Gen 具有促进海马神经元增殖和减缓PTSD 海马病理进程的作用。神经递质失衡尤其是5-HT 能神经功能不足是PTSD主要病理特征之一[14-15]。中枢5-HT 能神经元主要分布于脑干中缝核团内，包括中缝背核和中缝大核[16]。中缝背核位于中脑尾侧和脑桥颅侧平面，含有的5-HT 能神经元数量最多，中缝背核的5-HT 能神经纤维广泛投射到海马等与PTSD 病变密切相关的重要脑区，海马组织内含有丰富的5-HT 能投射纤维，这些投射纤维的末梢释放5-HT，作用于海马神经元上的5-HT受体，海马神经元胞膜上含有多种5-HT受体亚型，由海马神经元发出的神经纤维则广泛投射到额叶皮质、杏仁核等与情感有关的脑区，参与情感、镇痛、睡眠等机制的调节[16]。本实验采用ELISA 法检测了各组大鼠海马组织5-HT 含量，结果显示，PTSD 模型组海马组织5-HT 含量低下，且随造模后随观察时间的延长呈不断下降趋势，较之模型组，低、高剂量Gen 组和氟西汀组大鼠海马组织5-HT 含量均有显著升高，高剂量Gen 组大鼠14 天时的5-HT含量居各组最高值。这提示Gen 和氟西汀均具有提高PTSD大鼠海马组织5-HT含量的作用。

Figure 2. Distribution（A，B）and numbers（C，D）of beclin 1（A，C）and LC3（B，D）positive neurons in hippocampus of the rats（immunofluorescence labeling，scale bar=50 μm）. Mean±SD. n=5. **P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs PTSD group.图2 大鼠海马beclin 1和LC3阳性神经元的形态与分布

Figure 3. Expression of beclin 1 protein in hippocampal tissue of each group. Mean±SD. n=5. **P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs PTSD group.图3 各组大鼠海马组织beclin 1蛋白的表达

Figure 4. Expression of LC3 protein in hippocampal tissue in each group. Mean±SD. n=5.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs PTSD group.图4 各组大鼠海马组织LC3蛋白的表达

表4 各组大鼠海马组织5-HT含量Table 4. 5-HT concentration in hippocampal tissue in each group（μg/L. Mean±SD. n=5）

有研究显示，在PTSD 发病过程中，海马神经元存在异常凋亡和自噬现象，这可能是PTSD 海马脑区体积缩小的原因之一[15，17]。自噬是细胞的自我更新现象，对维持细胞正常生长发育和新陈代谢必不可少，并且也参与一些疾病的发生过程。LC3 和beclin 1 是哺乳动物的自噬相关蛋白。LC3 存在2 种形式：胞浆型（LC3-Ⅰ）和膜结合型（LC3-Ⅱ）。LC3-Ⅱ是自噬体的标志分子，LC3-Ⅱ总量或者LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ转变的比率与自噬泡的形成数量呈正相关[18-19]。beclin 1 参与自噬体的早期形成过程，可以正向调节自噬的发生[20]。在成年大鼠海马神经元上存在beclin 1 的表达[21]。然而，PTSD 发病过程中海马神经元是否存在异常自噬现象，鲜见文献报道。氟西汀为临床抗PTSD 的一线药物，具有抑制海马神经元过度自噬的作用[22-23]。本研究设氟西汀为阳性对照药，通过免疫荧光标记和免疫印迹技术检测海马神经元自噬水平，实验结果显示，模型组海马beclin 1 和LC3 标记的阳性神经元的数量较对照组有显著增多，beclin 1 和LC3 蛋白的表达水平也显著升高，而低、高剂量Gen组和氟西汀组海马beclin 1和LC3标记的阳性神经元数量不断减少，beclin 1 和LC3 蛋白表达水平也不断下降，提示Gen 和氟西汀均具有抑制PTSD 大鼠海马神经元过度自噬的作用。

海马组织5-HT 水平与海马神经元自噬之间是否有关联？本研究的Pearson 相关性分析显示，海马组织5-HT 含量与beclin 1 和LC3 蛋白水平之间存在显著负相关。由此，我们推测海马组织5-HT 含量不足可能与PTSD大鼠海马神经元过度自噬有关。

综上所述，PTSD 大鼠海马组织5-HT 水平低下，海马神经元自噬增强，5-HT 含量与神经元自噬之间存在显著负相关。Gen 可能通过提高海马组织5-HT含量，调节海马神经元异常自噬，进而改善大鼠PTSD 样行为。至于5-HT 如何调控海马神经元自噬的发生以及Gen 干预海马神经元自噬的具体机制仍有待深入研究。