和厚朴酚增强NK-92细胞对KG-1a细胞的杀伤作用及机制研究*

张海鹏， 陈 景， 陈秀云， 叶汉深， 李 军， 张普山， 佘妙容， 李晓红△

（1广东省医学科学院，广东省人民医院输血科，2广东省心血管病研究所广东省华南结构性心脏病重点实验室，3广东省医学科学院，广东省人民医院医学研究部，4广东省医学科学院，广东省人民医院血液科，广东广州510080）

急性髓细胞白血病（acute myeloid leukemia，AML）是一种预后差，生存率低下且容易复发的异源性克隆性疾病，其特征在于未成熟髓样细胞的增殖和存活增加[1]。AML 是成人白血病常见的分型，患者的年龄越大，预后越差[2]。化疗和异体造血干细胞移植是当前AML 的主要治疗方法[3-4]。但老年患者常有多种基础疾病，且免疫力低下，身体状况难以支撑整个疗程。中药不但可以通过调节机体平衡提高患者免疫力，同时具有抗肿瘤的作用。和厚朴酚（honokiol）是从木兰科植物中提取的一种重要的具有生物活性的双酚类化合物，具有包括抗炎、抗氧化、抗肿瘤和神经保护特性等多种生物功能[5-6]。研究显示和厚朴酚可抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞自噬或凋亡[7-9]。自然杀伤（natural killer，NK）细胞对肿瘤细胞的识别是通过种系编码的激活受体介导的，该受体与DNA 损伤和细胞应激等一些恶性转化细胞过程引起的肿瘤细胞上调的配体结合，从而杀伤肿瘤细胞。我们前期的研究显示，白血病细胞能够逃逸体内NK 细胞的杀伤，其机制与其表面自然杀伤细胞2 族成员D（natural-killer group 2 member D，NKG2D）配体低表达有关[10]。KG-1a 细胞是常用的高表达CD34 的AML 细胞株[11]，NK 细胞对KG-1a的杀伤能力尚不清楚。因此，本研究拟探讨和厚朴酚对KG-1a 细胞增殖的抑制作用，及其具体作用机制是否与提高NKG2D 配体UL16 结合蛋白（UL16 binding proteins，ULBPs）水平有关，为AML的治疗研究提供参考资料。

材料和方法

1 主要试剂

和厚朴酚购于中国食品药品检定研究院（批号：110730-201614），纯度≥99%；胎牛血清和RPMI-1640培养液购于英潍捷基公司；重组人白细胞介素2（recombinant human interleukin，rIL-2）购于PeproTech；DMSO 购自Sigma；乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）杀伤活性检测试剂盒（Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST）购自Dojindo；PE Annexin V/7-ADD凋亡检测试剂盒I 和小鼠抗人CD3 FITC 购自BD；兔抗人ULBP1 抗体、小鼠抗人ULBP3 抗体、小鼠IgG1κ FITC同型对照和小鼠IgG1κ APC同型对照购自eBioscience；小鼠IgG1κ PE 同型对照和小鼠抗人CD56 PE（NCAM）购自TONBO；小鼠抗人ULBP2 购自Sigma；羊 抗兔IgG-PE 购 自Santa Cruz；羊 抗小鼠IgG（H+L）购自Life Technologies；FALCON 40 μm 细胞滤网购自BD。KG-1a 细胞和K562 细胞由南方医科大学附属珠江医院血液研究室赠予；NK-92 细胞购自浙江杭州CTCC。

2 主要方法

2.1 细胞培养 KG-1a 细胞和K562 细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640 培养液中，NK-92 细胞培养于含12.5%胎牛血清、12.5%马血清和1×105U/L rIL2 的αMEM 培养液中，37℃、5%CO2常规条件下培养，每3 d 换液传代培养，取对数生长期的细胞进行实验。

2.2 药物处理及实验分组 称取20 mg和厚朴酚溶解于1 mL 二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），终浓度为0.02%。根据预实验结果及文献报道[12-13]，设8个剂量组，各组浓度分别为5、10、15、20、25、30、35和40 μmol/L，空白组作为对照。

2.3 流式细胞术检测NK-92 细胞纯度 离心收集NK-92 细胞，PBS 洗涤，用移液管轻轻吹散重悬于PBS 中，调整细胞密度为1×1010/L，取200 μL 细胞悬液于5 mL 流式管中，分别加入FITC 标记的鼠抗人CD3和PE标记的鼠抗人CD56（NCAM），同型对照是加 入FITC 标 记 的 鼠 源IgG1κ 和PE 标 记 的 鼠 源IgG1κ。室温孵育20 min，40 μm 细胞滤网过滤，流式术检测CD3-CD56+细胞所占比例。

2.4 CCK8 法测定和厚朴酚对KG-1a 细胞的生长抑制作用 取对数生长期的KG-1a 细胞，制成1×108/L的单细胞悬液后加入不同体积的和厚朴酚溶液，使每组和厚朴酚浓度分别为5、10、15、20、25、30、35、40、45 和50 μmol/L；以每孔100 μL 接种于96 孔板，每个剂量分别设4 个复孔，并设正常细胞作对照组；培养24 h 后每孔加入10 μL 的CCK8 溶液，37℃避光继续培养4 h，波长450 nm 的酶标仪检测吸光度（absorbance，A），以空白组平均值调零，根据A值计算KG-1a 细胞相对活力。细胞相对活力（%）=（实验组A值-本底对照组A值）/（对照组A值-本底对照组A值）×100%。

2.5 LDH 法检测NK-92 细胞对KG-1a 细胞的杀伤作用 NK-92 细胞分别以1∶1、5∶1、10∶1 和20∶1 的效靶比与K562 细胞或10 μmol/L 和厚朴酚处理前后的KG-1a 细胞共培养4 h 后，用LDH 试剂盒进行检测。详细实验步骤参考Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST说明书。细胞损伤率根据如下公式算出。细胞损伤率（%）=（实验组平均值-靶细胞低对照平均值-效应细胞低对照平均值）/（效应细胞高对照平均值-效应细胞高对照背景平均值-效应细胞低对照背景平均值）×100%。实验重复3次。

2.6 流式细胞术检测凋亡 调整K562 细胞和KG-1a 细胞的密度为1×106个，加入10 μmol/L 和厚朴酚，收集加药前后的细胞沉淀，1×PBS 洗涤，随后加入1 mL 1× Binding Buffer 重悬，吸取100 μL 悬液分别加入20 μL PE Annexin V 和5 μL 7-ADD，室温避光孵育20 min，用1× Binding Buffer 洗涤重悬后上流式细胞仪检测。

2.7 流式细胞术检测KG-1a 细胞表面NKG2D 配体表达 收集K562细胞、KG-1a细胞及经10 μmol/L 和厚朴酚处理24 h 的KG-1a 细胞，200×g离心5 min，PBS 洗涤，吸干净上清，重悬于200 μL PBS 中，分别加入5 μL 抗体（抗ULBP1、ULBP2 和ULBP3 抗体及同型对照），室温避光孵育40 min，用PBS 洗涤，弃去上清后，按照1∶300 浓度加入羊抗兔IgG-PE 和羊抗小鼠IgG（H+L）FITC，室温避光孵育30 min。用PBS洗去未结合的抗体后，重悬于200 μL PBS，用40 μm细胞滤网过滤后上机检测。

3 统计学处理

采用SPSS 16.0 软件进行统计分析。数据以均数±标准差（mean±SD）表示。多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用最小显著性差异法（LSD法）。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1 NK-92细胞的特征

NK-92 细胞生长较快，成团簇状生长，常由各个小团块融成大的团块，较难打散成单个细胞（图1A）。流式细胞术检测NK-92细胞的表面标志物，显示CD3-CD56+的细胞比例为99.24%（图1B）。

Figure 1. Characteristic of NK-92 cells. A：morphological changes of NK-92 cells observed under light microscope（scale bar=200 μm）；B：surface markers of the cells detected by flow cytometry.图1 NK-92细胞的特征

2 KG-1a细胞对和厚朴酚的敏感性

CCK8 细胞毒性实验结果显示，和厚朴酚干预24 h 后，随着和厚朴酚浓度的增加，相对于5 μmol/L浓度组，其他各浓度的和厚朴酚对KG-1a 细胞的杀伤作用显著提高（P＜0.05），其中25、30、35 和40 μmol/L 的和厚朴酚对KG-1a 细胞的杀伤效果相当，组间差异无统计学显著性（P＞0.05），见图2。

Figure 2. The cycotoxicity effect of honokiol at different concentrations on KG-1a cells（dose-response curve）. Mean±SD. n=3. *P＜0.05，**P＜0.01 vs 5 μmol/L group.图2 不同浓度的和厚朴酚对KG-1a 细胞的细胞毒作用（剂量-反应曲线）

3 和厚朴酚增强NK-92 细胞对KG-1a 细胞的杀伤力

LDH 法检测结果表明，在相同的效靶比情况下，KG-1a 细胞对NK-92 细胞的杀伤敏感性显著低于K562 细胞（P＜0.01）；当用10 μmol/L 和厚朴酚处理KG-1a 细胞24 h 后，NK-92 细胞对KG-1a 细胞的杀伤作用显著增强，并且随着效靶比的增加，杀伤效果逐渐增强，在效靶比为1∶1、5∶1、10∶1和20∶1时杀伤率（用药前vs用药后）分别为0.69%±0.17%vs30.26%±0.37%、1.45%±0.18%vs35.02%±0.96%、3.70%±0.04%vs36.00%±0.56%和10.38%±0.06%vs36.44%±0.32%，差异均有统计学意义（P＜0.01），见图3。

4 和厚朴酚增强NK-92 细胞诱导的KG-1a 细胞凋亡

选用效靶比5∶1 检测NK-92 细胞对KG-1a 细胞的凋亡诱导作用。流式细胞术结果显示，NK-92 细胞诱导KG-1a细胞的凋亡率为9.37%±0.14%。使用10 μmol/L 和厚朴酚处理KG-1a 细胞24 h 后，NK-92细胞诱导KG-1a 细胞的凋亡率上升为39.85%±0.65%（P＜0.01），见图4。这表明10 μmol/L 的和厚朴酚处理KG-1a 细胞能够显著增强NK-92 细胞诱导的KG-1a细胞凋亡。

Figure 3. Cytotoxic effects of NK-92 cells on KG-1a cells at different effector-to-target cell ratios（NK-92 cells to KG-1a cells）. The concentration of honokiol was 10 μmol/L. Mean±SD. n=3. **P＜0.01 vs KG-1a group.图3 不同效靶比的NK-92细胞对KG-1a细胞的细胞毒作用

5 和厚朴酚上调KG-1a细胞的NKG2D配体表达

流式实验结果显示，与K562 细胞相比较，未经处理的KG-1a 细胞表面的NKG2D 配体ULBP1、ULBP2 和ULBP3 的表达量显著较低（P＜0.05）。使用10 μmol/L 的和厚朴酚处理KG-1a 细胞24 h 后，其表面NKG2D 配体ULBP1、ULBP2 和ULBP3 表达均比未处理前显著上调（P＜0.05，图5）。

Figure 4. Honokiol（10 μmol/L）significantly enhanced NK-92 cell-induced apoptosis of KG-1a cells. Mean±SD. n=3. **P＜0.01 vs KG-1a group.图4 10 μmol/L和厚朴酚显著增强NK-92细胞对KG-1a细胞的凋亡诱导作用

讨论

本研究显示NK-92 细胞对K562 细胞的杀伤率随着效靶比的增高而逐渐增高，提示NK-92 细胞杀伤力良好。而NK-92 细胞对未经和厚朴酚处理的KG-1a 细胞的杀伤作用很低，提示KG-1a 细胞对NK-92 细胞杀伤敏感性低。这可能就是AML 复发的原因。在经过和厚朴酚处理后，NK-92细胞对KG-1a细胞杀伤作用显著提高，提示厚朴酚可以显著增强NK-92细胞对KG-1a细胞的杀伤作用。

我们的研究结果显示KG-1a细胞表面的NKG2D配体ULBP1、ULBP2和ULBP3的表达量都很低，这与Chen 等[14]的 研 究 一 致。与 对NK-92 细 胞 敏 感 的K562 细胞相比，NK-92 细胞对KG-1a 细胞的杀伤能力较弱。流式细胞术结果显示K562 细胞的NKG2D配体表达水平高于KG-1a细胞，这可能是KG-1a细胞对NK-92 细胞杀伤不敏感的原因。而经过和厚朴酚刺激24 h 后，KG-1a 细胞表面NKG2D 配体ULBP1、ULBP2 和ULBP3 表达均显著上调。KG-1a 细胞经和厚朴酚处理后，再用NK-92 细胞作用于KG-1a 细胞，发现后者的凋亡率比未经和厚朴酚处理组明显升高。这说明和厚朴酚可能通过上调KG-1a 细胞表面NKG2D 配体的表达来促进NK-92细胞对KG-1a细胞的杀伤作用。NK 细胞是先天免疫所必需的细胞毒性淋巴细胞，其对癌症的细胞毒性由多种激活和抑制受体调节。NKG2D是NK-92细胞表面表达较多的激活性受体。NKG2D通过与NKG2D配体相互作用，在NK 细胞对肿瘤的免疫监视中起关键作用[15]。NKG2D 配体表达增加可以抑制NF-κB 和PI3K 信号通路，从而提高NK 细胞肿瘤免疫治疗的效果[16]。研究发现靶细胞表达NKG2D 配体会刺激NK 细胞的细胞毒性IFN 产生，而NKG2D 通过与肿瘤细胞表面的ULBPs 结合可以起到激活NK 细胞，从而增强小鼠的抑瘤作用[17]。

Figure 5. The expression levels of NKG2D ligands in different cells. The expression of ULBP1，ULBP2，and ULBP3 in K562 cells and KG-1a cells（with or without honokiol treatment）was detected by flow cytometry. Mean±SD. n=3. *P＜0.05，**P＜0.01 vs KG-1a group.图5 NKG2D配体在不同细胞的表达情况

既往的报道都是研究和厚朴酚对肿瘤细胞的直接作用，联合其他化疗药物或者单独使用对肿瘤细胞的抑制作用[18-19]，鲜见研究涉及和厚朴酚对NK 细胞杀伤毒性的调控。本研究采用细胞实验证实了中药成分和厚朴酚能增强NK-92 细胞对KG-1a 细胞的杀伤作用，其机制可能是通过提高KG-1a 细胞的NKG2D 配体表达，从而增加NK-92 细胞诱导的细胞凋亡。本研究体外实验明确了和厚朴酚对KG-1a 细胞的抑制作用，但尚需在动物体内进行验证，并进一步研究NKG2D 配体上调后的下游信号通路变化，为AML的免疫治疗提供了参考资料。