中药大承气汤改良方对术后肠梗阻小鼠胃肠功能的影响及机制研究*

李 敏， 林思思， 刘胜远， 徐晓娟， 李 琨， 李永渝， 刘晓红

（1遵义医科大学基础医学院生理教研室，2遵义医药高等专科学校生理教研室，贵州遵义563000；3同济大学医学院病理生理教研室，上海200092；4遵义医科大学附属医院外科，贵州遵义563000）

术后肠梗阻（postoperative ileus，POI）是指因腹部或非腹部的一些大手术后出现的胃肠运动功能抑制，临床常表现为腹痛、腹胀、恶心、呕吐和排便排气停止等[1-2]。多数患者术后胃肠运动抑制时间短暂，2～3 d 内可自行恢复，但有少数患者抑制状态持续时间较长，甚至发展为麻痹性肠梗阻，由此增加术后其他并发症的发生风险，加重病情，延长住院时间以及增加医疗费用等[3-4]。对POI 的发病机制，至今尚未完全阐明，涉及的因素认为有手术前后药物的干扰（止痛药、麻醉药等的使用）、手术诱发的神经体液调节失衡、免疫介导、电解质紊乱和炎症反应等[5]。有研究报道，术后患者可能存在肠粘膜屏障的损伤，由此引起肠道菌群紊乱、肠道细菌和内毒素易位等，这些因素促进炎症反应，加重胃肠运动的障碍[6-8]。因此，如何保护肠道菌群稳态，进而控制炎症反应，对于术后肠梗阻的防治显得尤为重要，也成为临床和基础医学相关领域研究的热点课题[9]。

大承气汤（Da-Cheng-Qi-Tang，DCQT）为中医经方，也是治疗阳明脏腑实证的基础方，由大黄、厚朴、芒硝和枳实4 味药组成。现代研究报道大承气汤具有抗炎、调理胃肠功能等作用[10]；临床研究看到大承气汤可以改善阑尾术后患者的早期炎性肠梗阻[11]。如我们所知，手术后患者由于元气受损，多存在气血亏虚之症，大承气汤虽可改善胃肠功能的恢复，但属峻下之药。如果对大承气汤进行加味，取其改善胃肠运动之功效，同时增加具有补益元气、健脾和胃功效的当归、人参、白术和白芍（改良大承气汤），可能更有利于术后肠功能紊乱患者的恢复。本课题组在前期实验中，就传统大承气汤和改良大承气汤对实验性POI 小鼠的治疗效果进行比较，结果揭示它们均具有促进胃肠道运动功能恢复的作用，在改善POI炎症反应方面，改良方的效果更为明显[12]。

本研究在前期工作的基础上，采用经典的小肠干扰术（intestinal manipulation）诱导肠梗阻小鼠模型[13]，通过观察改良大承气汤对POI 小鼠胃肠运动、炎症反应、胃肠肽水平、肠道神经递质及肠道细菌状态等方面的影响，进一步探讨腹部术后胃肠功能的变化及改良大承气汤的作用及其机制，以期为其临床应用提供动物实验的依据。

材料和方法

1 材料

1.1 动物 8～10 周C57BL/6J 小鼠48 只（SPF 级），体重为18～23 g，雌雄不拘，购自上海灵畅生物科技有限公司[许可证号为SCXK（沪）2018-0003]。动物饲养于同济大学动物实验中心，在温度为（25±3）℃、湿度（55±5）%的环境下喂养至少1周后进行实验，整个过程给予标准实验饮食。

1.2 药物 大承气汤改良方组成：大黄（后下）12 g，厚朴15 g，枳实12 g，芒硝（冲）9 g，当归12 g，人参12 g，白术12 g，白芍12 g，购自上海同仁堂中药店。煎药方法：一剂中药→冷水泡2 h→常规煎2次（首次煎1.5 h，次煎1 h）→两次所煎药液混合、过滤→浓缩，大黄在首次煎的后20 min 加入。96 g 生药浓缩成96 mL 汤剂，即含生药1 g/mL。按照成人剂量及体表面积折算，小鼠用量为1.37 g·kg·d-1×9.1=12.47 g·kg·d-1=0.12 g·kg·d-1，即0.12 mL·kg·d-1，分2 次服用，间隔时间6 h。

1.3 主要试剂 Milliplex MAP 小鼠细胞因子/趋化因子磁珠试剂盒购自上海默克密理博公司（MCYTOMAG-70K，3255835）；ELISA 试剂盒购自上海通蔚生物有限公司（20190501-20010A 和20190501-20879A）；细菌16S rRNA 测序相关试剂购自Illumina（AC7500，Omega Bio-tek）；阿拉伯胶购自Sigma；食用型活性炭末购自上海生工生物工程公司（A502167-0001）。

1.4 主要仪器 DM2500 显微镜（Leica）；Elx800 酶标仪（BioTek）；Luminex 液相芯片多重检测分析仪MAGPIX 10299001（Merck）；Illumina MiSeq 高通量测序仪（Omega Bio-tek）。

2 方法

2.1 POI小鼠模型复制及分组处理 根据预实验结果，POI时机体最明显的变化发生在术后24和48 h，由此选择这两个时点作为药物干预作用的效果比较。每个观测时点各用成年C57BL/6 小鼠24 只，雌雄不拘，随机均分为4 组：正常对照（control）组（n=6）、假手术（sham）组（n=6）、POI 组（n=6）和POI+DCQT 组（n=6）。各组小鼠自由饮水条件下禁食12 h后接受实验。参照Kasparek 等[13]报道的方法，用经典小肠干扰术复制小鼠POI 模型，简述如下：用恩氟烷麻醉小鼠后仰卧置于手术台上，脱毛、消毒；沿腹白线打开腹腔，用无菌纱布洞巾置于小鼠腹部，2 根生理盐水润湿的无菌棉签轻柔地将小肠肠段从腹腔移出置于纱布上，并从空肠近端（Treitz 韧带处）到回肠末端来回滚动并轻柔挤压3 次，共用时15 min；刺激完毕后将小肠回纳入腹腔，双层连续性缝合关闭腹腔；sham 组开腹后不干预肠管，其他操作同上。手术完毕，POI+DCQT 组小鼠给予DCQT 灌胃（12 mg·kg-1·d-1，分2 次服用，间隔6 h），每只小鼠每次灌胃时间约5 s，其余各组用饮用水替代DCQT灌胃。

2.2 指标检测

2.2.1 胃肠排推运动 参考Li等[14]的方法，用炭末复合物灌胃（10%阿拉伯胶+10%食用型活性炭末，10 mL/kg），20 min 后在恩氟烷麻醉下，眼眶取血、颈椎脱臼处死小鼠。取出全段小肠，测量小肠全长以及炭末推进的距离。小肠推进率（%）=炭末在小肠内推进距离/小肠总长度×100%。将血液离心，取上清液，立即冻存备用。

2.2.2 组织病理学观察 取近盲肠的一段回肠和结肠固定于4%甲醛溶液，乙醇脱水、石蜡包埋、切片，苏木素-伊红（hematoxylin and eosin，HE）染色。用光学显微镜观察肠道组织病理改变。

2.2.3 胃肠激素水平 血清血管活性肠肽（vasoactive inestinal peptide，VIP）和胃动素（motilin，MTL）水平用ELISA 试剂盒，按照说明书介绍的方法测定，结果以ng/L表示。

2.2.4 血清炎症介质水平 用液态芯片技术完成，按照Milliplex 说明书，分别检测血清白细胞介素（interleukin，IL）-1α、IL-4、IL-5、IL-6、IL-17、干扰素γ（interfenon-γ，IFN-γ）、单核细胞趋化蛋白1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的水平，结果以ng/L表示。

2.2.5 回肠组织中5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）和组胺（histamine，HIS）水平 回肠组织称重，按照10 mg 样本∶100 μL PBS 的比例制成匀浆，离心后取上清液，蛋白定量，用ELISA 检测试剂盒，按说明书要求进行检测，计算出单位组织重量中5-HT 和HIS的活性，结果以ng/g表示。

2.2.6 结肠黏膜细菌检测 取距盲肠1 cm 左右处的结肠1 cm，剖开清除粪便，用生理盐水轻柔冲洗肠壁后将肠管放入盛有样品保护液的试管中，常温放置。后续由奥美德诺生物技术有限公司完成DNA提取、纯化和定量，进而扩增16S rRNA的V3和V4基因片段，高通量测序。每个样品测序得到PE300 的100K原始序列，进行生物信息学分析，最后得到α多样性指数分析和β多样性分析结果。

3 统计学处理

用SPSS 20.0软件进行统计分析。数据用均数±标准差（mean±SD）或均数±标准误（mean±SEM）表示（在相应结果处有标示）。组间均数比较采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1 肠道组织病理学

与正常对照组或假手术组比较，小肠干扰术后24 h 和48 h，小鼠肠道（回肠和结肠）组织都表现出不同程度的病理变化，主要有绒毛上皮细胞排列紊乱、黏膜下充血、水肿、炎症细胞浸润等，2 个时点的变化无显著差异；DCQT 治疗组小鼠的肠组织损伤有所减轻，无论术后24 h 还是48 h，黏膜充血、水肿均有缓解，炎症细胞浸润明显减少，见图1。

2 胃肠运动功能的改变

与正常对照组相比，假手术组的24 h 及48 h 胃肠排推率稍有降低，但差异无统计学意义（P＞0.05）；与假手术组或正常对照组相比，POI 组小鼠术后24 h 及48 h 胃肠排推率显著降低（P＜0.01），两个时点的降低程度之间差异不显著（P＞0.05）；DCQT 干预后，24 h 或48 h 胃肠排推率的降低均有逆转，与POI组比较均有显著差异（P＜0.05），见图2。

Figure 1. Effects of Da-Cheng-Qi-Tang（DCQT）on the pathological changes of the ileum（A）and colon（B）tissues in the mice with postoperative ileus（POI）. Representative micrographs of hematoxylin and eosin（HE）-stained tissues 24 h and 48 h after intestinal manipulation were shown. The scale bar=60 μm in the first 4 columns of the images，and the scale bar=30 μm in the last column of the images. Hyperemia and inflammatory cells were indicated by a circle（○）.图1 DCQT对POI小鼠回肠和结肠组织病理变化的影响

Figure 2. Effects of Da-Cheng-Qi-Tang（DCQT）on gastrointestinal transit rates in different treatment groups at 24 h（A）and 48 h（B）after intestinal manipulation. Mean±SD. n=6. **P＜0.01 vs sham or control group；#P＜0.05 vs POI group.图2 DCQT对小肠干扰术后24和48 h胃肠排推运动的影响

3 胃肠激素水平的变化

如图3 所示，与正常对照组相比，无论术后24 h还是48 h，假手术组小鼠血清VIP 和MTL 水平均无显著差异（P＞0.05）；而POI 组与sham 组相比，血清VIP 水平显著升高（P＜0.01），血清MTL 水平显著降低（P＜0.01）；DCQT 治疗可逆转此变化，即降低VIP水平（P＜0.01），提高MTL水平（P＜0.01）。

4 血清促炎细胞因子变化

高通量液态芯片技术检测8 个细胞因子的血清水平，有显著变化的如图4 所示。其中，促炎细胞因子IL-1α、IL-6、TNF-α、MCP-1 和IL-17 的血清水平在假手术组与正常对照组之间无显著差异（P＞0.05）；与sham 组相比，无论在术后24 h还是48 h，POI组小鼠血清IL-1α、IL-6 和TNF-α 水平均显著升高（P＜0.01或P＜0.05），MCP-1 和IL-17 水平在24 h 时点增高显著（P＜0.05）；POI+DCQT 组小鼠血清IL-1α、IL-6、IL-17、TNF-α和MCP-1水平都有不同程度降低，与POI组比较均有显著差异（P＜0.05）。

Figure 3. Effects of Da-Cheng-Qi-Tang（DCQT）on serum levels of gastrointestinal hormones in different treatment groups at 24 h（A，C）and 48 h（B，D）after intestinal manipulation. A，B：serum vasoactive inestinal peptide（VIP）level；C，D：serum motilin（MTL）level. Mean±SEM. n=6. **P＜0.01 vs sham or control group；##P＜0.01 vs POI group.图3 DCQT对小肠干扰术后小鼠血清胃肠激素水平的影响

5 回肠组织5-HT和HIS水平

在术后24 h 或48 h，假手术组与正常对照组相比较，小鼠回肠组织中5-HT 和HIS 水平无显著差异（P＞0.05）；而与假手术组或正常对照组比较，POI组小鼠回肠组织中5-HT 水平降低，HIS 水平升高（P＜0.01）；DCQT 干预可一定程度逆转HIS 和5-HT 水平的变化，与POI 组相比较差异均有统计学意义（P＜0.01或P＜0.05），见图5。

6 肠道菌群变化

如图6 所示，在术后48 h 时点，POI 小鼠无论肠道菌群结构还是肠道菌群多样性均发生显著改变，与假手术组相比差异均有统计学意义（P＜0.05），见图6A、B、E；而在POI+DCQT 组，其肠道菌群结构和菌群多样性变化虽然与POI 组无显著差异（P＞0.05），但变化趋势更接近于假手术组，见图6C、D、E。

讨论

POI的发病机制比较复杂，炎症反应在其中起有重要作用。研究证实，手术操作对肠道的刺激可引起一系列免疫反应，导致巨噬细胞和肥大细胞激活以及核转录因子的活化，从而产生和释放大量促炎细胞因子和趋化因子，引起局部甚至全身性的炎症反应[12]。Lin 等[4]研究报道，POI 小鼠肠道菌群总数及大肠杆菌等细菌数量明显增加，并有大肠杆菌易位到肝、脾等组织。肠道细菌易位可进一步刺激机体免疫细胞和炎症相关信号通路，扩大炎症反应，促进POI的发生发展[15-16]。

Figure 4. Effects of Da-Cheng-Qi-Tang（DCQT）on serum levels of inflammatory mediators at 24 h（A，C，E，G，I）and 48 h（B，D，F，H，J）after intestinal manipulation. A，B：IL-6 level；C，D：MCP-1 level；E，F：TNF-α level；G，H：IL-1α level；I，J：IL-17 level. Mean±SEM. n=6. *P＜0.05，**P＜0.01 vs sham or control group；#P＜0.05 vs POI group.图4 DCTQ对POI小鼠血清炎症介质水平的影响

本实验通过经典小肠干扰术复制POI 小鼠模型，16S rRNA 测序技术的结果也证实，腹部手术干预后肠道菌群结构和菌群多样性都出现明显变化，结合Illumina MiSeq System 测序平台，揭示肠道菌群在POI 小鼠的特异性富集。肠道菌群紊乱可引起或加重局部和全身的炎症反应[17]，本实验显示回肠和结肠组织的充血、水肿和炎症细胞浸润，血清中促炎细胞因子IL-1α、IL-17、IL-6、TNF-α 和MCP-1 水平的显著升高都证实POI 时炎症反应的存在。这些炎症介质可能通过多种机制，如直接的细胞毒作用、诱导一氧化氮和前列腺素的合成等，导致胃肠动力下降[18]。已知肠道神经递质5-HT 与肠黏膜下层和肌间神经丛的5-HT1A受体结合可调控肥大细胞释放HIS[19]；5-HT 与5-HT2b和5-HT3受体结合可使胃肠道平滑肌收缩，引起胃肠道蠕动[20-21]。本实验看到POI小鼠5-HT 和HIS 释放异常，再有促动力的胃肠激素MTL 水平降低，这些因素共同作用，使胃肠平滑肌收缩减弱。胃肠运动功能障碍导致肠内容物滞留，促使肠内细菌过度生长及菌群紊乱，加上手术干预、炎症反应以及肠屏障的损伤，肠壁通透性增加，肠道菌群易位成为可能。因此，菌群失调-炎症反应-胃肠运动障碍在POI 的发生发展过程中相互联系，互为因果。

Figure 5. Effects of Da-Cheng-Qi-Tang（DCQT）on 5-hydroxytryptamine（5-HT）and histamine（HIS）levels in the ileum at 24 h（A，C）and 48 h（B，D）after intestinal manipulation. A，B：5-HT；C，D：HIS. Mean±SEM. n=6. **P＜0.01 vs sham or control group；##P＜0.01 vs POI group.图5 回肠组织5-HT和HIS水平的变化

术后胃肠运动功能的恢复被认为是POI 患者恢复的核心标志之一。以往的临床报道和我们的前期实验结果，已初步证明传统中药大承气汤对POI 的治疗作用[22]。有研究报道，DCQT 可逆转胃肠运动功能的降低，其作用机制可能与其修复组织损伤、维持肠内神经间质细胞包括Cajal 平滑肌细胞网络的完整性、增加血液胃动素水平和抗炎作用有关[23]。本实验用的改良DCQT 由DCQT 加味所得。方中大黄可泻热通便，荡涤肠胃；芒硝助大黄泻热通便，并能软坚润燥，二药相须为用，峻下热结之力甚强；辅以厚朴、枳实行气散结，消痞除满，并助大黄、芒硝推荡积滞[24]。基于术后存在气血不足的现象，方中增加当归改善血液循环和通便，人参可以减少疲劳和增强身体机能，白术用于脾胃虚弱和湿热引起的食欲不振、排便异常，白芍则可除血痹、破坚积、止痛、利小便、益气等。诸药并用可改善术后肠梗阻的胃肠运动功能，这在本实验中得到进一步证实。同时，本实验还揭示，改良DCQT 可以降低血清炎症介质水平，抑制POI 小鼠的炎症反应；可能通过调节肥大细胞和肠嗜铬样细胞的分泌活动，逆转局部神经递质5-HT 和HIS 的异常；逆转胃肠激素VIP 和MTL 的变化；改善POI 小鼠肠道菌群结构和菌群多样性的变化。这些作用可直接或间接地阻断腹部手术后出现的菌群失调-炎症反应-胃肠运动障碍等连锁反应及因果转化，帮助和促进术后胃肠运动功能的恢复。

Figure 6. Effects of Da-Cheng-Qi-Tang（DCQT）on intestinal flora structure and diversity in the colon at 48 h after intestinal manipulation. A，B：intestinal flora structure and difference in sham and POI groups ；C，D：intestinal flora structure and difference in POI and POI+DCQT groups；E：intestinal flora diversity. *P＜0.05.图6 小鼠结肠菌群结构和菌群多样性的改变

综上所述，腹部术后常伴有胃肠运动功能障碍，其发生发展与肠道菌群紊乱、炎症反应和胃肠肽失衡等因素有关。改良DCQT 可促进POI 小鼠胃肠运动功能的恢复，其作用机制可能包括：（1）改善肠道菌群结构及多样性，促进术后肠道菌群稳态的恢复；（2）下调炎症介质的血清水平，减轻POI 小鼠的炎症反应；（3）纠正胃肠肽和局部神经递质的失衡。