雷公藤甲素调节NF-κB通路对脓毒血症大鼠心肌损伤的保护作用*

孙贝贝， 陈雪梅， 王烁阳， 杨 倩， 杨永芝， 朱 红， 陈雪祎， 王海华△

（1皖南医学院生理教研室，2皖南医学院临床医学院，3皖南医学院口腔医学院，安徽芜湖241002）

脓毒血症是宿主对感染或损伤的全身有害反应，严重者会造成休克。大量研究表明，心肌功能障碍是脓毒血症患者的常见并发症。然而，脓毒血症引起的心肌功能障碍的确切机制尚不明确[1]。相关研究显示，心肌的炎症以及炎症信号的持续激活是脓毒血症心功能障碍的起始环节[2]。诸多研究显示，Toll 样受体信号通路的下游信号分子NF-κB 在免疫应答和炎症的各个阶段的早期生物进程扮演了重要角色，尤其与心肌炎性损伤密切相关[3]。由于脓毒血症心肌损伤病死率高，同时没有安全有效的药物，因此探讨脓毒血症心肌损伤发病机制和寻求有效防治药物至关重要。

雷公藤甲素（triptolide，TP）是从药用植物雷公藤中分离出来的主要活性天然产物，这些化合物表现出相似的药理活性，在肿瘤和炎症的发展中起着至关重要的作用[4]。近期研究表明，TP通过下调NFκB 信号通路减轻膜性肾小球肾炎大鼠的炎症反应[5]，TP 通过抑制NF-κB 的活性和表达来减轻小鼠急性肺损伤[6]，TP 通过NF-κB 通路抑制小胶质细胞活化改善脊髓损伤[7]，但其在脓毒血症心肌损伤中的作用机制和作用靶点尚不明晰。本文应用CLP 法构建脓毒血症模型，进一步探讨雷公藤甲素在脓毒血症心肌损伤中的器官保护机制，为脓毒血症心肌损伤提供参考资料。

材料和方法

1 动物

60 只SPF 级3 月龄雄性SD 大鼠（290±20）g 许可证号SCXK（鲁）20140007，适应性喂养一周。

2 药物试剂与仪器

TP（T819207-20 mg，纯度≥98%，上海麦克林生化科技有限公司）；cTn-I 酶联免疫试剂盒（南京建成生物工程研究所）；CK-MB、IL-6 和TNF-α 酶联免疫试剂盒（武汉华美生物工程有限公司）；兔抗鼠GAPDH 单克隆抗体，兔抗鼠TLR4 单克隆抗体和兔抗鼠NF-κB p65 单克隆抗体（武汉三鹰有限公司）；兔抗TAK1（抗体CST）；ECL 化学发光液（上海生物工程有限公司）；PowerLab8-35Power Lab 系统（埃德仪器公司）；电泳仪和转膜槽（Biorad）；超灵敏多功能成像仪AI600和高速离心机（GE）

3 实验方法

3.1 脓毒血症模型的建立 SD 大鼠用10%水合氯醛3 mL/kg 腹腔注射，麻醉后固定于鼠板，先去除腹部毛发，沿腹白线做1 cm 的中线切口，逐层打开腹腔，并找到盲肠。然后在盲肠末端1 cm处用3/0丝线紧密地结扎，并使用7 号针在距其远端约0.5 cm 处穿刺两次。挤出少量粪便放入腹腔。将盲肠放回其正常的腹腔内位置，并以两层闭合腹部。在没有CLP 的情况下，假手术（sham）组中的大鼠进行完全相同的程序。所有动物在手术后立即皮下注射30 mL/kg 生理盐水进行液体复苏并给予大鼠复温。48 h后大鼠出现精神萎靡、活动减少、食欲减退，解剖大鼠发现肠腔有水肿、黏连、血性液体，即造模成功[8-10]。

3.2 分组和给药 将60只大鼠随机分配为6组（n=10）：假手术（sham）组、CLP 组、CLP+TP-L（50 μg/kg）、CLP+TP-M（100 μg/kg）、CLP+TP-H（200 μg/kg）和CLP+PMX-B（1 mg/kg）组[11-14]。所有大鼠术前禁食，不限制饮水。采用CLP 法建立脓毒血症心肌损伤模型。TP各干预组和CLP+PMX-B组术后4 h腹腔注射药物，24 h 后再注射一次。48 h 后，麻醉处死大鼠，测试相应指标。

3.3 大鼠生存分析 构建脓毒血症模型后，每12 h观察大鼠的存活情况，连续观察72 h，统计生存率并进行比较。

3.4 血流动力学参数测定 大鼠麻醉后由右颈总动脉插管，通过PowerLab 系统先测定平均动脉压（mean arterial blood pressure，MABP），再测左心室收缩峰压（left ventricular systolic pressure，LVSP）、左心室舒张末压（left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP）、心率（heart rate，HR）、左心室内压最大上升/下降速率（maximal increase/decrease rate of left ventricular pressure，±dp/dtmax）。

3.5 HE 染色 采血后立即取大鼠的心脏，然后放入40%多聚甲醛溶液中固定。将组织脱水和石蜡包埋，然后进行病理切片。HE 染色后，切片在55℃烘箱中烘20 min后封片，并在光学显微镜下观察。

3.6 大鼠血清中CK-MB 和cTn-I 含量和血浆中TNF-α和IL-6的含量测定 CLP术后48 h采血，取两份血液分别放入肝素抗凝管和普通EP 管中，静置离心后分血浆和血清备用。通过相应的酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒，测定平均吸光度（A）值。

3.7 Western blot 法检测TLR4、TAK1 和NF-κB p65的表达情况 称取0.05 g 心肌组织提总蛋白，每个样品取200 uL 上清液，加入5× SDS-PAGE 上样缓冲液50 μL，在沸水中变性5 min，行8% SDS-PAGE 后，电转移法将蛋白转移至PVDF膜，然后用脱脂奶粉封闭2 h 后，放入Ⅰ抗（1∶1 000）中过夜孵育，然后在Tris 缓冲盐水吐温中洗涤3 次，加入Ⅱ抗（1∶5 000），并孵育1 h。电化学发光（ECL）用于显影图像。通过ImageJ 软件分析靶蛋白条带的灰度值。实验进行了3次。

4 统计学处理

所有数据均由SPSS 17.0 统计软件处理。测量数据以平均值±标准差（mean±SD）的形式表示。数据符合正态分布时使用单因素方差分析进行多组之间的比较。以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

结果

1 各组大鼠72 h生存率分析

结果显示：sham组大鼠72 h内均没有出现死亡，与sham 组相比，CLP组存活率下降（P＜0.05），与CLP组相比，CLP+TP-M、CLP+TP-H 组和CLP+PMX-B 组均能提高大鼠生存率（P＜0.05），见图1。

Figure 1. Comparison of rat survival rate in each group.Mean±SD.n=10.**P＜0.01 vs sham group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs CLP group.图1 各组大鼠生存率的比较

2 各组大鼠MAP和心功能变化

心功能指标检测结果显示，与sham 组相比，CLP 组大鼠MABP、LVDP×HR 和±dp/dtmax显著降低（P＜0.05）；与CLP 组相比，CLP+TP-M 组、CLP+TP-H组和CLP+PMX-B 组大鼠MABP、LVDP×HR 和±dp/dtmax均显著升高（P＜0.05），见图2及表1。

3 各组大鼠血清中CK-MB和cTn-I含量

CLP 组CK-MB 和cTn-I 含 量 高 于sham 组（P＜0.05）；TP各干预组和CLP+PMX-B组CK-MB和cTn-I 含量均低于CLP 组（P＜0.05）；与CLP+TP-L 组比较，CLP+TP-M、CLP+TP-H 和CLP+PMX-B 组中CKMB和cTn-I含量显著降低（P＜0.05），见表2。

4 各组大鼠血浆中TNF-α和IL-6含量

CLP 组TNF-α 和IL-6 含 量 高 于sham 组（P＜0.05）；TP 各干预组和CLP+PMX-B 组TNF-α 和IL-6含量均低于CLP 组（P＜0.05）；与CLP+TP-L 组比较，CLP+TP-M、CLP+TP-H 和CLP+PMX-B 组中TNF-α 和IL-6含量显著降低（P＜0.05），见表3。

5 各组心肌组织病理变化

HE 染色结果显示，sham 组心肌细胞完整，肌纤维清晰排列，无炎症细胞浸润；CLP组可见血管扩张充血，心肌细胞灶状变性坏死，炎症细胞浸润；与CLP 组相比，CLP+TP-L 组未见明显炎症细胞浸润，但心肌细胞肿胀，横纹消失，细胞核固缩；而CLP+TP-M、CLP+TP-H 和CLP+PMX-B 组心肌细胞病理改变好转趋于正常，见图3。

6 各组大鼠心肌组织中TLR4、TAK1 和NF-κBp65蛋白的表达

Figure 2. Changes in cardiac function of rats in each group.图2 各组大鼠心功能变化

表1 各组大鼠心功能变化Table 1. Changes of cardiac function in rats in each group（Mean±SD. n=10）

表2 各组大鼠血清中CK-MB和cTn-I含量比较Table 2. Comparison of CK-MB and cTn-I levels in serum of rats in each group（Mean±SD. n=10）

表3 各组大鼠血浆中TNF-α和IL-6含量比较Table 3. Comparison of TNF-α and IL-6 levels in plasma of rats in each group（Mean±SD. n=10）

Figure 3. Pathological results of myocardium with HE staining. A and D：the cardiomyocytes in sham group were intact；B and E：in CLP group，vascular dilatation and congestion，focal degeneration and necrosis of cardiomyocytes，and inflammatory cell infiltration were observed；C and F：in CLP+TP-L group，the myocardial cells were swollen；G-L：transverse striae disappeared and nuclei were shrunken. The pathological changes of myocardial cells in CLP+TP-M，CLP+TP-H and CLP+PMXB groups were improved and tended to be normal. Scale bar=100 μm in A，B，C，G，H and I；scale bar=20 μm in D，E，F，J，K and L.图3 HE染色心肌病理结果

Western blot 结果显示，CLP 组TLR4、TAK1 和NF-κB p65 蛋白表达量显著高于sham 组（P＜0.05）；CLP+TP-M、CLP+TP-H和CLP+PMX-B组TLR4、TAK1和NF-κB p65 蛋白表达量均低于CLP 组（P＜0.05）；而CLP+TP-L 组TLR4 和NF-κB p65 蛋白表达量与CLP组相比无显著差异（P＞0.05），见图4。

Figure 4. Expression levels of TLR4，TAK1 and NF-κB p65 proteins in myocardium of rats in each group. Mean±SD. n=10. *P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs CLP group；△P＜0.05 vs CLP+TP-L group.图4 TLR4、TAK1和NF-κB p65蛋白在各组大鼠心肌中的表达水平

讨论

临床上耐药菌株的日渐增多与抗菌药物的滥用有关，导致了脓毒血症患者的抗生素疗效不尽人意，新型抗菌药物的研发及其临床应用滞后，致使脓毒血症患者死亡的发生率居高不下[15]。通过盲肠结扎穿刺法复制大鼠脓毒血症更接近临床患者病理进程，是研究其发生发展机制的合适模型[16]。多器官功能障碍和衰竭是临床上脓毒血症患者常见的并发症，心脏是脓毒血症造成的常见受损靶器官[17]。心肌的炎症以及炎症信号的持续激活是脓毒血症心功能障碍的起始环节[2]。深入探究脓毒血症的发病机制并寻求有效的防治药物对于防治脓毒血症尤为重要。

本实验复制的脓毒血症大鼠体内致病菌革兰氏阴性菌最常见，细菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革兰氏阴性细菌外膜的主要成分，当LPS 进入大鼠体内与Toll 样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）受体结合，活化NF-κB 信号通路，NF-κB 主要以p65-p50 二聚体的形式存在，p65 亚基与多种炎症性疾病有关[18-19]。炎症疾病中，由巨噬细胞产生的肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）在脓毒血症导致的心肌炎性损伤中扮演重要角色[20]。多黏菌素B 常用于治疗临床难治性革兰阴性菌感染患者[21]。

TP具有抗炎、免疫调节等药理作用，我们研究室前期实验证实TP 能改善内毒血症大鼠血管低反应性，可能是通过TLR4/NF-κB 通路保护内皮功能实现的[14]。TLR4/NF-κB 通路是经典的炎症信号通路，不仅刺激细胞因子的表达，而且致使炎症反应级联放大，TAK1 通过激活的JNK 和p38 MAPK 发起MKK 级联，刺激IκB激酶，导致NF-κB活化，在此信号转导级联效应中起着关键调节作用[22-23]。

cTn-I存在于心肌细胞中，血清中cTn-I水平与心肌功能损伤程度呈正相关，CK-MB 是诊断心肌损伤特异性较高度的酶[24]。MABP 反映血管张力变化，HR×LVDP 代表心脏做功，+dp/dtmax和-dp/dtmax绝对值大小，反映大鼠心脏收缩和舒张功能强弱[25]。

作为临床上常用的有效的抗炎药雷公藤甲素，对于其作用机制研究是当今研究的热点，有关其通过抗炎作用在脓毒血症心肌损伤中的作用及其作用机制研究尚鲜有文献报道[26]。实验结果表明，与sham 组相比，CLP 组大鼠生存率低，心功能显著下降，心肌血管扩张充血、炎症细胞浸润、细胞灶状变性坏死；血清中CK-MB、cTn-I及血浆中TNF-α和IL-6的含量显著增高，心肌TLR4、TAK1 和NF-κB p65 的蛋白表达显著增多；与CLP 组相比，TP 干预后，呈剂量依赖性提高脓毒血症大鼠生存率，改善其心肌结构和功能，使血清中CK-MB 和cTn-I及血浆中TNF-α和IL-6 的含量显著降低，心肌TLR4、TAK1 和NF-κB p65 的蛋白表达亦显著减少。实验结果证实，TP 干预后对脓毒血症大鼠心肌损伤有明显的保护作用。

综上所述，通过TP 干预后，TP 能降低CLP 大鼠体内TNF-α 和IL-6 的释放，使 其 血 液 中CK-MB 和cTn-I 的含量减少，从而对CLP 大鼠心肌损伤起到明显的保护作用，其效应可能与抑制TLR4/TAK1/NFκB信号通路有关。