速度向量成像技术定量评价健心颗粒对心力衰竭大鼠左房功能的影响

欧阳秋芳 郭进建 游 涛 姚涵文 刘磊磊 连艳平 林济钦 曹 斌 苏林丘

(福建中医药大学附属第二人民医院 福建福州 350003）

左房功能是左心室舒张期灌注的决定因素，它间接反映左室的充盈压力，当心力衰竭时，左室舒张末期充盈压增加，左房后负荷升高，导致左房结构发生形变、功能受损。另外，左房功能下降，导致房内压力升高，不利于静脉血液回流，间接影响心室射血[1]。因此，左房功能与左心室舒张收缩功能密切相关而且相互影响，评价左房功能对疾病的病情评估、疗效观察和预后判断具有重要意义[2]。

速度向量成像（velocity vector imaging， VVI），采用实时心肌运动跟踪运算法，计算并以矢量方式显像二维超声心动图上组织结构的活动方向、速度、距离时相等，对心肌组织在多个平面运动的结构力学进行量化分析，能定量测量心肌组织运动的速度、位移、应变率等参数，为评价左房功能提供了更准确、简便的方法[3][4]。但目前尚无用VVI技术定量评价大鼠左房功能的文献报道。

本研究团队研究表明：根据温阳益气、活血利水法配制的院内制剂——健心颗粒，能显著改善心功能[5]，通过肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）调节神经内分泌细胞因子，抑制左室肌纤维化[6][7]。但是健心颗粒是否改善心衰大鼠左房结构与功能，尚无文献报导。因此，本文拟用VVI技术定量评价健心颗粒对心衰大鼠左房功能的影响，旨在证实VVI技术定量评价大鼠左房功能的可行性；并以此为技术手段，阐明健心颗粒是否通过改善左房功能治疗心力衰竭的新机制。

一、材料与方法

（一）药物的来源、组方及制备

健心颗粒原药材购于福建省药材公司，经鉴定后按照相关的制剂和质量标准由本院制剂室制成颗粒剂。

（二）动物模型及分组

将体重200g左右的SD大鼠50只，随机分成假手术组、模型组、健心颗粒小剂量组（剂量1.8g/kg/d）、健心颗粒大剂量组（剂量3.6g/kg/d）、苯那普利组（给予剂量10mg/kg/d），每组10只。按孙庆怡等报道的方法[8]，采用缩窄腹主动脉法制备慢性心衰大鼠模型。假手术组大鼠在游离腹主动脉后不结扎。于造模后第7天用多普勒超声测腹主动脉的狭窄程度，判断模型是否成功。对造模成功大鼠于第8天开始按上述方案灌胃给药，假手术组和模型组给予相同剂量的生理盐水。干预12周后进行相关实验研究。

（三）超声心动图分析左室功能及速度向量成像技术分析左房应变率

采用10%水合氯醛（3ml/kg）腹腔注射麻醉下采用西门子（Acuson S 2000型）超声仪进行超声心动图检查，剃掉大鼠胸前的毛，铺超及导声垫，M型和二维超声心动图测量左房左右径（left atrial diameter， LA）、左室舒张末期内径（left ventricular end diastolic diameter， LVEDD）、室间隔舒张末期厚度（interventricular septal end diastolic thickness， IVST）、左室射血分数（left ventricular ejection fraction， LVEF）与缩短分数（left ventricular shortening fraction， LVFS）。

超声仪自带分析软件为syngo US Workplace VVI自动分析软件。采集心尖四腔心连续3个心动周期动态超声图，启动VVI模式，在标准心尖四腔心切面显示清晰的房间隔和侧壁，连续采集3个心动周期的动态图像，存储后脱机分析。分析时，将图像帧频回放到左室收缩末期，逐点勾画心内膜边界，VVI软件将自动生成速度应变向量图（图1）。在四腔心切面自动获取收缩期峰值应变率（left ventricular peak systolic strain rate，SR-s）、舒张早期峰值应变率（left ventricular peak early diastolic strain rate，SR-e）及舒张晚期峰值应变率（left ventricular peak latediastolic strain rate，SR-a）的测量并记录，其中SR-s对应心电图的QRS波群起始点至T波终末期，SR-e、SR-a分别对应T波终末开始至QRS波群起始点之间。测得计算平均值，并记录。

图1

（四）ELISA法测血浆AngII、BNP水平

因血管紧张素II（Ang II）可致心房肌纤维化，而N末端脑钠肽（NT-proBNP）反映心功能，故血浆检测上述指标。断头取血，2ml血注入含10%二乙胺四乙酸二钠30μl和抑肽酶40试管中，混匀，4℃，3000r/min离心10min，分离血浆，-20℃存放。测定前冷水中复融，再次4℃，3000r/min离心5min后，取上清液，采用非平衡法测定。将聚苯乙烯试管编号，经过加液程序后混匀，4℃，3500r/min离心20min，吸取上清液，采用免疫放射法测定。在半对数坐标纸上绘制标准曲线，查出样品值。

（五）原位缺口末端标记法评估左房肌细胞凋亡

因细胞凋亡与左房功能密切相关，故检测凋亡程度。采用原位缺口末端标记（TdT-mediated dUTP nickend labeling， TUNEL）法对各组所取组织用10%中性缓冲福尔马林固定，常规石蜡切片。按“原位细胞凋亡检测试剂盒”说明进行检测。

（六）MASSON染色分析左房间质纤维化

打开已测定好血压大鼠的胸腔，分离心脏，切取左心耳并用10%中性甲醛固定。石蜡包埋，取左心耳冠状面最大横径处切片，行MASSON染色。胶原纤维染成蓝色，胞浆、肌纤维呈红色，而胞核为黑蓝色。胶原容积分数（collagen volume fraction， CVF）是指视野中胶原染色的区域面积占总面积的百分比。每张切片上随机选取8个视野，通过使用Image Pro Plus软件（version 6.0， USA）计算CVF来反映左心房纤维化程度，计算CVF时视野中血管周围区域不记入内。

（七）左房组织Western blot方法检测Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原表达

采用Western blot方法检测左房肌组织胶原蛋白的表达。提取左房总蛋白，进行蛋白质浓度定量后，对蛋白样品进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，封闭。采用Abcam公司抗体，以1：2000稀释I型和III型胶原一抗，二抗孵育，免疫印迹显色。以GAPDH作为内参，进行半定量分析，用图像分析系统对图片进行灰度扫描，比值表示其相对含量。

（八）统计学处理

使用SPSS 19.0软件，符合正态分布的计量资料用均数±标准差表示，均数比较采用成组设计单因素方差分析，组间均数比较采用LSD法。非正态分布资料采用Mann-Whitney U检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

二、结果

（一）AngII、NT-pro BNP水平、左室功能与左房峰值应变率

如表1，模型组和各治疗组的Ang II、NT-pro BNP水平均明显高于假手术组（P＜0.05）。与模型组比较，各治疗组上述指标均显著降低（p＜0.05）。超声心动图结果显示：与假手术组比较，模型组左室射血分数（EF）、缩短分数（FS）减低，而室间隔厚度（IVST）、左室舒张末径（LVEDD）、左房径增加，说明腹主动脉缩窄所致心力衰竭建模成功。低、高剂量健心颗粒或苯那普利治疗后，EF、FS增高，IVST、LVEDD减低，说明治疗后左心功能改善。

与假手术组比较，模型组左房SR-s（储库功能，0.96±0.07 vs 1.95±0.14，p＜0.01）与SR-a（辅泵功能，-0.57±0.05 vs -1.32±0.19，p＜0.01）显著增强，而SR-e（管道功能，-0.75±0.04 vs-0.36±0.05，p＜0.01）减弱。健心颗粒或苯那普利治疗后，SR-s、SR-a降低，而SR-e增加。

表1 各组血浆Angll、血浆NT-pro BNP、左室超声分析及左房应变率比较

（二）左房肌细胞凋亡

与假手术组相比，模型组左房凋亡细胞数明显增加（23.16%±3.19% vs 2.41%±0.47%，p＜0.01）。尽管健心颗粒治疗后的左房凋亡细胞数仍较假手术组严重（各治疗组均p＜0.01），但与模型组比较，高剂量健心颗粒治疗后，细胞凋亡明显减少（12.45%±2.16% vs 23.16%±3.19%，p＜0.01），与苯那普利组（10.60%±1.57%）比较，差异无统计学意义。低剂量健心颗粒治疗，细胞凋亡数稍减低（18.93±2.08），但与模型组比较（23.16%±3.19%），差异无统计学意义。

图2 左房肌组织的TUNEL染色结果（细胞核呈蓝绿色，凋亡细胞呈棕褐色，模型组大鼠心房肌凋亡细胞高于假手术组，健心颗粒、苯那普利治疗后，凋亡程度减轻。统计数据表示为x±s，n=10。与假手术组比较，*p＜0.05；与模型组比较，#p＜0.05。（×400）

（三）左房间质纤维化

胶原容积分数（CVF）代表左房纤维化的严重程度，Masson染色时胶原纤维呈蓝色，肌纤维和纤维素呈红色，蓝色染色面积的百分比为胶原容积分数。与假手术组相比，模型组左房CVF显著增加（24.52%±2.41% vs 3.65%±0.44%，p＜0.01）。尽管健心颗粒治疗后的左房肌纤维化仍较假手术组严重（各治疗组均p＜0.05），与模型组相比，健心颗粒低剂量和高剂量治疗组CVF显著降低（JXKL-和JXKL-H与模型组：15.53%±2.12%和8.94%±1.07% vs 24.52%±2.41%；p＜0.001），两组治疗均达到显著性差异。健心颗粒高剂量治疗组与苯那普利组间差异无统计学意义（8.94%±1.07% vs 6.68±0.73，p＞0.05）。

图3 左房肌组织Masson染色，胶原纤维呈蓝色，肌纤维和纤维素呈红色，模型组大鼠心房肌纤维化程度高于假手术组，健心颗粒、苯那普利治疗后，纤维化程度减轻。统计数据表示为±s，n=10。与假手术组比较，*p＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。（×400）

（四）左房肌Ⅰ、Ⅲ型胶原表达

与假手术组比较，模型组I、III型胶原表达及I/III型胶原比值均增加（I型：1.35±0.20 vs 0.43±0.05；III型：0.97±0.12 vs 0.41±0.06；I/III胶原比值：1.39±0.13vs1.05±0.03，），提示腹主动脉所致心衰大鼠左房出现胶原沉积，并以I型胶原增加为主。与模型组比较，低剂量及高剂量健心颗粒均抑制Ⅰ型（0.95±0.08和0.72±0.12 vs 1.35±0.20）和Ⅲ型胶原蛋白表达（0.75±0.08和0.62±0.11 vs 0.97±0.12），降低I/III型胶原比值（1.27和1.16 vs 1.39±0.20）。高剂量健心颗粒与苯那普利作用相似（p＞0.05）。

图4 各组大鼠心房肌组织的Western blot分析l、lll型胶原的表达及定量分析。数据表示为均数±标准差，GAPDH作为内参蛋白，3次实验产生相似的结果，如图所示其中1次实验的结果。*P＜0.05,与假手术组比较；#P＜0.05，与模型组比较。Collagen l:l型胶原，Collagen lll:lll型胶原。

三、讨论

左房在整个心脏功能中起着重要作用。它既可作为“存储器”，于左室收缩期存储血液；亦可充当肺静脉和左室之间的“管道”，在左室舒张早期输送血液由肺静脉进入左室；另外，左房作为“助力泵”，于舒张晚期主动收缩，增加左室充盈血量。左心房的存储、管道、助力泵功能分别占左心室充盈容积的40%、35%和25%左右，左房通过这3个功能来共同协助左室充盈，维持心输出量[9]。

本研究结果提示大鼠腹主动脉结扎12周后，出现室间隔增厚，左室射血分数降低、NT-pro BNP增高，左房扩大，SR-s、SR-a增高而SR-e降低。表明模型鼠出现了室壁肥厚、左心衰竭、左房重构、左房储库与辅泵功能增加而管道功能降低。左房功能紊乱的血流动力学机制可能为：心力衰竭时，由于左室舒张期充盈压升高，左心室容量负荷逐渐加重，房室间压差减小，从而导致舒张早期心室对心房的抽吸作用减低，左心房管道功能下降，后负荷增加；左房扩大，储备功能增强。根据Frank-Starling定律，左心房扩大即左心房前负荷增加，心房肌收缩增强；另外，因左室收缩末容量和压力增加，导致左房后负荷的增加亦使左心房纤维代偿性收缩增强，因此辅泵功能增强。

目前，左房功能的无创性评估方法主要有斑点追踪[10]、血流向量成像技术[11]、声学定量技术等[12]。但用VVI技术评价左房功能，临床较少见，亦无应用于动物实验研究的文献报道[13]。本团队前期研究表明左心房的三大机械功能可以在应变率曲线上定量评估：正向波收缩峰值应变率反映储库功能，负向波舒张早期应变率反映管道功能，负向波舒张晚期应变率反映辅泵功能[14]。本实验进一步证实速度向量成像可定量评价大鼠左房功能。本实验发现：与假手术组比较，模型组SR-s（1.95±0.14 vs 0.96±0.07，P＜0.05）、SR-a增高（-1.32±0.19 vs -0.57±0.05，P＜0.05)，而SR-e降低（-0.36±0.05 vs -0.75±0.04，P＜0.05）。健心颗粒或苯那普利治疗后，SR-s、SR-a降低而SR-e增加，说明健心颗粒或苯那普利可以降低心力衰竭大鼠左房储库与辅泵功能、增加管道功能。

肾素-血管紧张素系统（RAAS）参与心力衰竭的多种病理功能，如：心脏重构、心肌细胞凋亡、间质纤维化等[15]。血管紧张素转化酶抑制剂苯那普利能降低血Ang II水平，抑制心肌细胞凋亡与间质纤维化。本实现表明，与模型组比较，苯那普利显著降低血Ang II（328.93±42.09 vs 780.36±90.45，P＜0.05）水平，减少左房肌细胞凋亡数、降低CVF及Ⅰ、Ⅲ型胶原沉积。健心颗粒发挥与苯那普利类似的作用，可抑制血中Ang II水平，间接说明其作用机制可能与抑制RAAS系统有关。健心颗粒由黄芪、红参、蒲黄、丹参、猪苓、白术、桂枝、葶苈子组成。以黄芪、红参为君，益气通阳以治其本；臣以生蒲黄、丹参活血化瘀，通利血脉；佐以猪苓、桂枝通阳化饮利水；泽泻、葶苈子宣肺利水为使药。现代医学研究表明健心颗粒可以逆转左室肥厚[16]，改善左室功能，降低血浆血管紧张素II水平，抑制左室心肌细胞凋亡[17]。本研究表明健心颗粒同样可抑制左房肌凋亡与间质纤维化。

总之，VVI技术可无创定量评价大鼠左房功能；健心颗粒可改善心衰大鼠左房功能、减轻左房肌细胞凋亡与胶原沉积，本实验从新的视角为健心颗粒治疗心力衰竭提供了理论依据。但是，本实验尚需扩大样本量，进行进一步研究。