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EBV-DNA检测与鼻咽癌患者免疫状态及预后的相关性分析

2021-04-06路爱丽鲁广建

实验与检验医学 2021年6期
关键词:亚群鼻咽癌阳性率

路爱丽,鲁广建

(1.河南省新乡市第一人民医院 新乡医学院第五临床学院医学检验科,河南 新乡 453000;2.新乡医学院第一附属医院检验科,河南 新乡 453000)

EB病毒(EBV)感染与鼻咽癌的发病密切相关[1]。已有研究表明,在鼻咽癌高发地区,鼻咽癌组织中的EBV的EBER基因阳性率超过90%,大约53%~96%的首诊鼻咽癌患者在治疗前可检测到血液中存在EBV-DNA[2]。目前血浆中循环EBV-DNA载量已被确定为鼻咽癌的肿瘤标志物,也被作为筛查、监测和预测鼻咽癌疾病进展的重要标志。但在鼻咽癌患者中有关EBV与外周血免疫细胞亚群间的关系研究较少,这种改变对患者预后的影响也尚不清楚。此外,不同中心采用的EBV-DNA检测方法存在差异,其临床意义还有待更多临床数据的验证[3]。本研究以我院2017年1月至2021年1月收治的鼻咽癌患者60例为研究对象,采用PCR-荧光探针法检测EBV-DNA、流式细胞术检测免疫细胞亚群,分析EBV-DNA与鼻咽癌患者免疫状态及其与鼻咽癌分期和预后的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017年1月至2021年1月收治的鼻咽癌患者60例为观察组。纳入标准:⑴经活检确诊鼻咽癌;⑵均为实诊患者;⑶均采用基于鼻咽与颈部MRI扫描的根治性调强放疗。另选取同期在我院体验的健康者60例为对照组。观察组男41例,女19例;年龄21~76岁,平均(56.29±7.63)岁;对照组男38例,女22例;年龄19~77岁,平均(55.83±7.26)岁。两组性别、年龄差异无统计学意义(P>0.05)。观察组患者于入院后第一天(治疗前)和放射治疗四个月后各检测一次EBV-DNA和免疫淋巴细胞亚群。

1.2 方法

1.2.1 EBV-DNA检测方法 采用EBV核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光探针法),购自圣湘生物科技公司。具体如下:采集全血样本,取1 ml红细胞裂解液加入2 ml离心管,加入800μl全血样本,充分混匀,12000 rpm/min离心1 min,去上清;再加入1 ml红细胞裂解液,充分混匀,12000 rpm/min离心3 min,去上清;再加1 ml生理盐水,直接12000 rpm/min离心10 min,去上清;在管底白色沉淀中加入400μl核酸释放剂,震荡混匀,75°C恒温处理10 min后瞬时离心,备用。在上海之江宏石SLAN 96P扩增仪上进行PCR扩增,将待测样本、阴性对照、阳性对照以及定量参考品加入专用PCR反应管,按说明书要求设置反应参数,反应结束后记录Ct值。Ct值≤39为EBV-DNA阳性。

1.2.2 免疫细胞亚群检测 抽取受试者外周静脉血2 ml肝素抗凝,采用贝克曼CytoFLEX流式细胞仪及其分析软件,严格按其操作要求测定免疫淋巴细胞亚群,主要包括:CD3+T淋巴细胞、CD3+CD4+T淋巴细胞、CD3+CD8+T淋巴细胞、CD19+B淋巴细胞、CD56NK细胞的比例及CD4+/CD8+的比值。

1.2.3 相关定义及计算 灵敏度=a/(a+b);特异度=d/(c+d)。a、b分别为EBV-DNA阳性、阴性的鼻咽癌患者;c、d分别为EBV-DNA阳性、阴性的健康者。

1.3 统计学方法 使用SPSS 19.0软件进行统计分析。计数资料采用χ2检验。采用ROC曲线分析EBV-DNA阳性预测治疗后疾病进展情况的效能。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组EBV-DNA阳性率比较 观察组阳性率(81.67%)高于对照组(3.33%)(P<0.05),见表1。

表1 两组EBV-DNA阳性率比较

2.2 EBV-DNA阳性率与鼻咽癌分期的关系 根据AJCC分期标准(第八版),观察组患者中I期7例,其中EBV-DNA阳性3例(42.86%);II期12例,阳性8例(66.67%);III期28例,阳性26例(92.86%);IV期13例,阳性12例(92.31%)。早期(I+II)患者EBV-DNA阳性率为57.89%(11/19),晚期(III+IV)患者为92.68%(38/41),差异有统计学意义(χ2=10.495,P=0.001)。

2.3 EBV-DNA与免疫细胞亚群的关系 治疗前EBV-DNA水平与CD19+B细胞水平呈负相关(P<0.05),而与其他免疫细胞亚群水平不存在相关(P>0.05),见表2。

表2 EBV-DNA与免疫细胞亚群的关系

2.4 EBV-DNA检测结果与鼻咽癌进展的关系 调强放疗结束时进行EBV-DNA检测,其中阳性9例(15.00%),阴性51例(85.00%),随访12个月,无肿瘤进展47例(78.33%),复发或转移13例(21.67%)。放疗结束时EBV-DNA阳性患者复发或转移发生率(66.67%)高于阴性患者(13.73%)(P<0.05),见表3。

表3 调强放疗结束时EBV-DNA检测结果与鼻咽癌进展的关系

2.5 EBV-DNA阳性预测鼻咽癌进展的效能 放疗结束时EBV-DNA阳性预测鼻咽癌进展的敏感度为46.15%,特异度为93.62%,ROC曲线下面积为0.699(95%CI:0.515~0.882)(P<0.05),见图1。

2.6 CD19+B预测鼻咽癌进展的效能 治疗前CD19+B水平预测鼻咽癌进展的敏感度为88.72%,特异度为79.24%,ROC曲线下面积为0.729(95%CI:0.638~0.819)(P<0.05),见图2。

图2 CD19+B水平预测鼻咽癌进展的ROC曲线

3 讨论

早在上世纪末,已有研究者从鼻咽癌患者血液中发现EBV-DNA,因此认为EBV-DNA可作为诊断鼻咽癌的一项肿瘤标志物[4]。但是,EBV-DNA在临床中推广应用存在一个重要问题,即不同机构检测EBV-DNA的结果往往存在较大差异,其主要原因是检测方法学的不同,PCR技术应用过程中关于DNA提取、扩增方法、临界值选取等的差异,均可影响检测结果[5-6]。此外,有研究发现EBVDNA检测片段越小,结果阳性率越高,这说明DNA样本是一些碎片状态,可能增加检测的不稳定性[7]。本研究采用荧光定量PCR(探针法)检测EBV-DNA,该检测方法通过使用DNA结合染料、荧光PCR引物或探针等实时监测目的基因的扩增,从而对目的基因进行定量分析,具有较高的准确性。本研究通过系统分析EBV-DNA阳性与鼻咽癌患者免疫状态及其与鼻咽癌分期和预后的相关性,以期为EBV-DNA的研究提供更多循证资料。

本研究结果显示,观察组EBV-DNA阳性率(81.67%)高于对照组(3.33%);且早期患者EBVDNA阳性率(57.89%)明显低于晚期患者(92.68%)。已有研究表明,EBV-DNA阳性与鼻咽癌N分期以及临床分期均存在相关,随着分期的升高,阳性率呈现持续上升趋势[8-9]。本研究结论与此一致,说明EBV-DNA水平能够反映患者体内的肿瘤负荷。

已有研究表明,大部分发鼻咽癌患者(53%~96%)在接受放疗前血清EBV-DNA明显升高,但在放疗后即迅速降低[10-11]。Chan等[12]研究报道,EBV-DNA与鼻咽癌患者化疗预后有关,可作为筛选辅助化疗高危患者的指标。本研究结果显示,60例患者治疗前EBV-DNA阳性为49例,在调强放疗结束时进行检测,阳性患者仅为9例。对患者随访12个月,结果显示,放疗结束时EBV-DNA阳性患者复发或转移发生率(66.67%)高于阴性患者(13.73%),进一步证实治疗后EBV-DNA仍为阳性的患者预后较差,与黎晚霞等[13]研究结论一致。本研究中ROC曲线分析显示,放疗结束时EBVDNA阳性预测鼻咽癌进展的敏感度为46.15%,特异度为93.62%,ROC曲线下面积为0.699(95%CI:0.515~0.882),表明EBV-DNA可作为预测患者病情进展的有效指标。大样本(700例)长期(50.7个月)随访研究也表明,高载量的治疗前及治疗后EBV DNA是鼻咽癌预后不良的预测因子,其治疗失败的风险更高[13]。本研究与此符合,进一步证实治疗后EBV-DNA阳性是鼻咽癌疾病进展、出现复发或转移的最强有力的危险因素。因此建议对于放疗后仍为阳性的患者,应及时采取积极的挽救性治疗措施,以防止病情进展。但目前关于放疗后EBV-DNA仍为阳性的患者可从何种治疗方案中获益,还有待更多临床研究提供相关证据[14]。

从免疫的角度来看,部分鼻咽癌属于EBV感染的恶性疾病,鼻咽癌也是一种免疫相关疾病。病毒能够感染刺激机体产生免疫效应,而肿瘤的发生、发展、复发、转移等生物学行为,均与免疫功能状态有关。目前关于鼻咽癌患者中EBV-DNA与免疫细胞亚群的关系及对预后的影响的研究还较少,本研究结果显示,EBV-DNA与CD19+B细胞比例呈负相关,CD19是一种分子量为95000的糖蛋白,为最早发现的B淋巴细胞系表面标志。EB病毒载量引起CD19+B细胞比例改变在其他疾病中也有相应的研究证据[15]。本研究中ROC分析显示,治疗前CD19+B水平预测鼻咽癌进展的AUC值为0.729,具有较好的预测效能。

综上所述,EBV-DNA阳性可反映鼻咽癌的肿瘤负荷,与鼻咽癌分期及预后密切相关。放疗结束时EBV-DNA仍为阳性,以及治疗前CD19+B水平较低的患者长期预后较差,应尽可能采取适当的辅助治疗,以降低复发率,延长患者生存期。

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