EB病毒潜伏膜蛋白2的抗原表位预测及其与HLA等位基因的相关性分析

邹淑慧，黄薇，刘聪，邹翠翠，廖莎莎，张丽琴

（1.赣州市人民医院检验科，江西 赣州 341000；2.赣州市章贡区东外社区卫生服务中心，江西 赣州 341000）

EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）是一种人类疱疹病毒，与Burkitt’s淋巴瘤、胃癌以及鼻咽癌等肿瘤的发生密切相关[1]。有报道[2-3]称在鼻咽癌等恶性肿瘤组织中EBV能持续表达EBNA1、LMP1、LMP2等蛋白，可作为体内特异性CTL杀伤肿瘤细胞的靶分子。其中LMP2蛋白比较保守，含有HLA限制性CTL表位，诱导机体产生特异的T细胞反应，并且不具有细胞转化作用。因此，LMP2是研究抗EBV肿瘤疫苗的理想靶抗原。本研究将利用生物信息软件和网络相关数据库分析不同地理株系的EB病毒LMP2氨基酸序列的同源性，预测与之相关的B细胞和T细胞抗原表位，为EB病毒疫苗的设计和制备奠定基础。

HLA是人类主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）基因编码的产物，为人类主要的遗传标志。种族的和地区差异可导致其分布的不一致，因此具有高度多态性，而这多态性的差异决定了HLA在个体免疫中的应答能力以及对疾病的易感性都有所不同。此外，研究发现HLA分子可通过与外源性抗原结合，进而诱发CD4+T辅助细胞的免疫应答，并在免疫识别及清除病毒感染过程中发挥着关键性作用[4]。本研究将预测与EB病毒LMP2蛋白结合力较强的HLA等位基因，并通过数据库及文献验证推导出EB病毒的易感人群和可能发生流行的地区，为采取积极有效的防控措施提供依据。

1 材料和方法

1.1 EBV LMP2氨基酸序列的同源性比较 从GenBank中获得来自不同国家地区的EBV LMP2氨基酸序列，用Clustal X和Bioedit软件对序列进行比对，计算氨基酸同源性。

1.2 EBVLMP2蛋白的抗原表位预测 选取中国广东分离的LMP2蛋白序列（登陆号：ASU89583.1）为研究对象，运用生物信息学软件及相关网站，分析LMP2的表位类型。所用生物信息学软件有DNAStar程序包的Protean软件；生物信息网站有：细胞毒性T细胞（CTL）表位预测网站：http://crdd.osdd.net/raghava/nhlapred/；辅助T细胞（Th）抗原表位预测网站：http://crdd.osdd.net/raghava/propred/。

1.3 EB病毒与HLA等位基因的相关性分析及易感人群的预测 利用NetMHC和NetMHCII在线软件分析LMP2蛋白的滑动九肽与HLA分子的结合情况，筛选出与LMP2蛋白亲和力较高的HLA分子等位基因，而携带这些等位基因的人群可能是对EB病毒敏感的人群。并通过等位基因频率数据库及文献查询这些相关性较高的HLA等位基因在不同地域人群中的基因频率，推测出可能发生EB病毒流行的地区。

2 结果

2.1 EBV LMP2氨基酸同源性分析 通过比较EBV不同地理株系的LMP2蛋白氨基酸的同源性，结果显示该蛋白氨基酸序列相对保守，同源性在96.1%～100%，见表1，说明LMP2的抗原性可能无明显变化，这对疫苗的研制十分重要。我们选取中国广东分离的LMP2蛋白序列 （登陆号：ASU89583.1）为研究对象，进行下一步的细胞抗原性表位预测。

表1 EBV LMP2氨基酸的同源性比较

2.2 EBV LMP2蛋白的B细胞抗原表位 通过DNAStar程序包的Protean模块对EBV LMP2蛋白进行多参数预测，包括蛋白的亲水性、表面可及性、柔韧性以及抗原指数，见图1。根据LMP2蛋白单参数的预测结果，同时结合二级结构的预测进行综合分析，选择同时含有3种或3种以上参数预测的表位肽段，发现LMP2蛋白的10-82、90-109、173-179、199-205、235-241、289-294、379-383、413-421、484-494区段可能存在优势B细胞抗原表位，见表2。

表2 不同方案预测EBV LMP2蛋白B细胞表位的肽段位置

图1 EBV LMP2蛋白的B细胞表位预测

2.3 EBV LMP2蛋白的T细胞抗原表位

2.3.1 CTL细胞表位预测CTL抗原表位采用人工神经网络与量化矩阵法[5]进行预测，结合多肽选择HLA-A2、HLA-A*0201、HLA-A*0202、HLA-A*02 03及HLA-A*0205五种不同类型，阈值为0.5，见表3。综合选择共有的肽段，获得EBV LMP2蛋白的优势CTL细胞表位区段为119-127的SMNPVCLPV以及311-319的LASLILGTL。

表3 EBV LMP2蛋白CTL抗原表位预测

2.3.2 Th细胞表位预测 使用在线程序预测Th抗原表位[6],主要分析DRB1-0101、DRB1-0102及DR B1-0301三种分子结合肽，见表4所示。综合选择共有的肽段，获得EBV LMP2蛋白的优势Th细胞表位区段为224-232的LVMLVLLIL以及333-341的VVLLICSSC。

表4 EBV LMP2蛋白Th抗原表位预测

2.4 EB病毒与HLA等位基因的相关性分析及易感人群的预测 根据NetMHC和NetMHCII在线软件分析LMP2蛋白的滑动九肽与HLA分子的结合情况，筛选出与LMP2蛋白的滑动九肽亲和力较高的HLA分子等位基因，其中HLA-A*0201等位基因与LMP2蛋白具有高结合力，见表5。携带HLAA*0201等位基因的人群可能对EB病毒产生较强免疫应答而成为易感人群。

表5 EBV LMP2蛋白的滑动九肽与HLA等位基因的结合情况分析

通过对HLA等位基因频率数据库及相关文献的查验，我们发现HLA-A*0201在山西汉族人群中基因频率较高，为22.7%[7]，其次是北京汉族人群，基因频率为15.8%[8]，在石家庄、天津汉族人群基因频率为15.8%[9]，在江苏汉族人群基因频率为13.0%[10]，在广州汉族人群基因频率为12.8%[11]，提示EB病毒更有可能在这些地区的发生流行。

2 讨论

EB病毒与多种淋巴和上皮源性肿瘤密切相关，人群中的感染率较高，约有90%以上的人群曾感染EBV[12]。疫苗的研制和应用是目前防治EB病毒感染最有效的手段，由于表位疫苗可人为设计、易于制备，增强特异性细胞免疫应答的同时又能减少无关反应，因此已成为疫苗研究的趋势和热点[13]。随着生物信息学技术发展的日趋成熟，生物信息学软件的应用可实现表位的预测和设计，增强实验的针对性，大幅度减少实验工作量，加快研究进展。

EBV LMP2蛋白可维持病毒处于潜伏感染状态，并参与调控细胞的分化、凋亡、增殖、侵袭转移，是免疫治疗的理想靶抗原[14-15]。本研究利用软件对EBV LMP2蛋白的B细胞和T细胞抗原表位进行预测，发现10-82、90-109、173-179、199-205、235-241、289-294、379-383、413-421、484-494aa区段可能存在优势B细胞抗原表位，而CTL细胞表位和Th细胞表位可能分别位于119-127、311-319aa区段和224-232、333-34aa区段。这些表位与其他文献报道[16]的表位区域存在部分差异，可能是预测方法的原理不尽相同，上述预测的表位序列在理论上是具有成为表位的特征，但还需要通过CTL杀伤实验或体内转基因小鼠的进一步验证。我们的研究可为寻找候选疫苗抗原提供更加丰富的研究基础，为潜伏感染诊断标志物的发掘以及诊疗抗体的研制提供一定依据和参考。

虽然有些多肽疫苗已经进入临床研究，但仍远远不够，还需鉴定及开发更多的表位，尤其是在人群中所占比例较高的HLA分子呈递的表位，这些表位将为设计和研究更多理想的多肽疫苗奠定基础。HLA是通过其多态性控制抗原肽的选择性结合而影响细胞免疫的，因此HLA是病原易感性个体差异的主要决定者。不同人群中HLA基因频率分布差异很大。本研究利用NetMHC和NetMHCII软件分析发现与LMP2蛋白亲和力较高的HLA分子等位基因是HLA-A*0201，并根据其在中国不同地区的基因频率，预测出EB病毒可能在山西、北京、石家庄、天津、江苏、广州地区更易发生传播。