LDL-C的测定：现状与发展

何紫云，鄢盛恺

（遵义医科大学检验医学院，贵州 遵义 563006）

众所周知，低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）是动脉粥样硬化性心血管疾病（atherosclerotic cardiovascular disease，ASCVD)的独立危险因素，也是调脂治疗的首要靶标，因此，LDL-C测定的准确性及标准化对于ASCVD的防治至关重要。LDL-C的临床检测经历了从公式法到匀相测定法（直接法）的发展，近年来国内外相继报道了一些新的检测方法及基于LDL的新的临床检测项目如低密度脂蛋白颗粒（LDL particles，LDL-P）、小而密低密度脂蛋白胆固醇（small and dense LDL cholesterol，sd LDL-C）、低密度脂蛋白甘油三酯（LDL triglyceride，LDL-TG）、低密度脂蛋白鞘磷脂（LDL sphingomyelin，LDL-SM）等，极大地丰富了基于LDL的临床检测项目及其在ASCVD防治中的应用价值。

1 LDL-C的测定

临床上通过测定LDL-C水平进行ASCVD患者的管理，从而提高对患者的诊治水平。研究表明，LDL-C每降低1mmol/L，主要心血管事件和全因死亡的相对风险分别降低22%和10%[1]。2020年ESC/EAS血脂异常管理指南强调LDL-C在ASCVD一级和二级预防中的重要性，建议高危患者的LDL-C水平应控制在1.8 mmol/L或更低水平，并提出更为严格的LDL-C分级治疗目标[2]。由于LDL-C与心血管疾病之间的紧密关系，以及它在临床实践中的重要性，准确测定患者的LDL-C水平尤为重要。传统LDL-C的检测方法如超速离心法、电泳法、Friedwald公式法（间接法）、沉淀法、免疫法、匀相测定法等一直在不断更新与优化，测定的标准化也越来越受到临床实验室的重视。LDL-C的测定方法、基于LDL的几种新的检测指标及其方法比较，见表1。

表1 基于LDL的检测指标与方法比较

1.1 Friedwald公式法 Friedwald公式法（简称F公式）最早于1972年提出，是目前临床检测LDLC较为常用的方法，也是美国胆固醇教育计划（national cholesterol education program，NCEP）推荐的常规检测方法。该法通过测定总胆固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白胆固醇 （high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）计算而得，即LDL-C=TC－HDL-CTG/5（以mg/dl计）或LDL-C=TC－HDL-C－TG/2.2（以mmol/L计），具有简便、快速、直接等优点，适用于大部分人群LDL-C的测定[3]。由于F公式以极低密度脂蛋白（very low density lipoprotein，VLDL）组成恒定（VLDL-C/TG=0.2，均以mg/dl计）的假设为前提，受脂蛋白变异程度影响较大，当待测样本中存在乳糜微粒（chylomicron，CM）、β脂蛋白（如Ⅲ型高脂血症）及TG＞4.52 mmol/L时，不宜采用此公式。此外，新型调脂药物如前蛋白转化酶枯草溶菌素9（proprotein convertase subtilisin/kexin type 9,PCSK9）单克隆抗体的使用，使得一些患者的LDLC水平远低于1.81 mmol/L，此时使用F公式估算LDL-C可能存在很大负偏差，这将影响ASCVD高危患者的进一步治疗[4]。

1.2 匀相测定法 目前临床实验室测定血清LDLC普遍采用匀相测定法（直接法），其原理基于不同的表面活性剂（或特异性抗体等）特异性遮蔽或溶解其余脂蛋白，然后直接定量测定LDL-C，包括表面活性剂清除法（SUR法）、过氧化氢酶清除法（CAT法）、可溶性反应法（SOL法）、保护性试剂法（PRO法）和杯芳烃法（CAL法）等。这类方法无需对样本进行预处理，具有所需标本少、操作简便、易于自动化等优点，因此在国内外得到迅速发展和应用[5]。但这些方法测定LDL-C仍存在偏差较大的问题，有些试剂尚不能满足NCEP分析质量目标要求。美国疾病控制与预防中心（Center for Disease Control and Prevention，CDC）的超速离心-肝素锰沉淀-AK胆固醇测定法[也称为β-定量法(beta quantification，BQ法)]，是国际上广泛认可的LDL-C测定参考方法，被NCEP所推荐，也是国际临床化学会联合溯源委员会（JCTLM）参考方法列表中列出的唯一的LDL-C参考方法（https://www.bipm.org/jctlm/）。美国国家标准与技术研究所（NIST）研制的3个批次的参考物质CRM 1951a、1951b和1951c（每个批次为2个不同浓度水平的冰冻人血清）均用此法定值。我国目前已有国家一级标准物质GBW09178-09180和GBW09193-09196等几种LDL-C冰冻血清，使用的是小体积BQ法定值。应该注意的是，冰冻血清对于LDL-C测定可能不具互通性，将其用于常规方法溯源或不同常规方法间的比对并不十分可靠，用其校准的分析系统检测实际样品时可能会产生偏差。行之有效的LDL-C标准化方法可能是使用参考方法与常规方法且都使用新鲜血清进行一分为二的样品比对[6]。Yano等[7]应用日本协和（Kyowa Medex）和日本积水（Sekisui Medical）公司两种不同LDL-C匀相测定法试剂，分别对198例新鲜高TG血清样本[≥1.7 mmol/L（150 mg/dl）]进行测定，结果表明两法具有很强的相关性；同时，对其中32例LDLC结果有明显差异或高甘油三酯血症[TG≥4.5mmol/L(400mg/dl)]标本应用BQ法进行测定，结果显示两法与BQ法均具有很好的相关性。最近Kayamori等[8]比较了日本临床化学学会（JSCC）推荐的自动化测定LDL-C的参考方法（基于超速离心—硫酸葡聚糖镁沉淀结合酶法分析的原理）与传统BQ法测定47例健康对照和126例病例[TG＜11.29 mmol/l(1000 mg/dl)]血清LDL-C水平。结果表明，两者具有很好的一致性（r=0.999），显示这种准确、简便、自动化的方法可用于LDL-C定量分析及测定的标准化。

1.3 Martin/Hopkins公式法 Martin/Hopkins公式法（简称Martin公式）是基于垂直自动超速离心（vertical auto profile,VAP）技术直接计算LDL-C的新方法，即LDL-C=TC-HDL-C-TG/可调因子（以mg/dl计）[9]。该公式最大的优势在于LDL-C浓度极低时，可准确计算LDL-C，且对标本是否禁食无特殊要求，方便患者检查和临床样本收集。Song等[10]用近18万韩国人群队列数据比较了多个LDL-C的计算公式，认为Martin公式可能是评估亚洲人群LDL-C与ASCVD风险关联的最佳方法。因此，2018年包括ACC/AHA在内的多个学会血脂管理指南均推荐Martin公式作为低LDL-C首选估算方法[11]。Martin公式与F公式类似，不同点是依赖于用TG与非HDL-C水平的可调因子来估算LDL-C，多数情况下，两者测定的结果具有良好的一致性。但对于严重的高TG血症患者，由于CM和VLDL等大颗粒脂蛋白增加，可致Martin公式测得LDL-C结果偏低；此外，使用Martin公式进行LDL-C估算时，还需在实验室信息软件中查找最佳调节因子，操作过程较F公式更为复杂。

1.4 Sampson公式法 Sampson公式法是利用美国国立卫生研究院数据库推导出的一种适用于高TG（≥9.03 mmol/L）标本估计LDL-C的新方法，即：计），特别适用于LDL-C水平极低和TG水平极高患者LDL-C水平的估算[12]。Martinez-Morillo等[13]进行了F公式、Martin公式与Sampson公式估算LDL-C准确性的比较研究，认为Sampson公式可能是临床实验室计算LDL-C的一种经济有效的替代方法。Piani等[14]研究比较了包括F公式在内的12种不同公式计算LDL-C水平，结果显示，Martin公式和Sampson公式最具优势。Sampson公式相较于Martin公式最明显的特点是在大多数实验室信息系统可以自动计算，更易在一般临床实验室推广使用。

2 LDL-P的测定

LDL颗粒是血液循环中胆固醇的主要载体，其在动脉内膜的聚集可造成动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）及ASCVD的发生发展。与LDL-C测定的是LDL颗粒中的胆固醇质量不同，LDL-P测定的是LDL颗粒的实际数量（颗粒浓度），是从LDL颗粒的具体数量来反映LDL水平的，相比LDL-C而言其更能直观反映LDL对血管内皮损伤的危害程度。因为每个LDL所含的胆固醇含量不同，LDL颗粒数量可能比颗粒大小更重要，尤其是LDL-C与LDL-P不一致时，LDL-P可能比LDL-C更能预测心血管事件的风险，更适用于判断他汀治疗后心血管残余风险并指导调整治疗方案[15]，因此，LDL-P的临床检测与应用越来越受到各国学者的重视。通常建议ASCVD中危患者的LDL-P应＜1200 nmol/L，高危或极高危患者则应＜1000 nmol/L[16]。目前测定LDL-P的方法主要有：VAP技术、凝胶电泳法（gel electrophoresis，GE）及核磁共振波谱法（nuclear magnetic resonance spectroscopy，NMR）等。

2.1 VAP技术VAP技术是一种基于DGUC的改良技术，通过单垂直旋转密度梯度超速离心分离脂蛋白。其通过特殊的缓冲液和离心体系可有效缩短离心时间，且无需患者空腹，不受TG水平干扰，能满足临床快速检测的要求。该法可在1h内同时测定脂蛋白颗粒（含LDL-P）和亚组分的胆固醇含量（含LDL-C），是美国国家脂质协会（NLA）等组织推荐使用的方法。Williams等[17]使用VAP技术检测136例冠状动脉造影患者LDL-P含量，测定结果精密度高[变异系数(CV)＜5%]。但该法需特殊设备且运营成本高，在项目测定标准化、溯源性等方面仍有一些问题需要解决，且我国缺乏多中心标准化的对比实验数据。美康生物科技血脂亚组分检测用VAP仪器及配套试剂盒已获国家药品监督管理局注册证，这将极大地推动VAP技术在我国的临床研究及其在ASCVD防治中的应用。

2.2 凝胶电泳法 凝胶电泳法（GE）是以琼脂凝胶、聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gradient gel，PAG）等作为支持介质的区带电泳法，根据LDL-P在电场中的迁徙率不同将LDL中的各种颗粒成分分离。基于GE法的LDL-P测定方法包括梯度凝胶电泳法（GGE）、管状凝胶电泳法（TGE）和PAGE等。GGE的优势在于具有高分辨能力且已有商业化的试剂，但对操作者的熟练程度要求高、分离时间长（＞12h）且结果的自动化分析困难限制了此方法的应用。Quantimetrix公司研发出LipoprintTM脂蛋白分析系统已获美国食品和药物管理局（FDA）认证批准，具有高效快速、低实验消耗等优点，与GGE法具有良好的相关性。该系统根据脂蛋白颗粒大小和所带电荷多少，通过3%高分辨率聚丙烯酰胺管状凝胶电泳法（PTGE）分离LDL和HDL，可在1h内把LDL分成7个亚型，同时测定包括LDL-P在内的各种脂蛋白颗粒大小、表型及浓度。Varady等[18]通过测定16例肥胖者在4个不同时间点的LDL-P的大小，比较了此法与PAGE之间的一致性，发现尽管两种方法在不同LDL颗粒（大、中、小）大小分布方面有很好的一致性，但LDL-P大小绝对值之间还是存在一定差异，LipoprintTM脂蛋白分析系统测定LDL-P大小比PAGE法结果整体偏高（1.1±3.0A）。

2.3 NMR技术NMR技术是利用不同脂蛋白颗粒脂质甲基独有的核磁共振光谱信号区分脂蛋白组分并进行脂蛋白颗粒定量测定的方法。该法测定LDL-P具有较好精密度（批内、批间CV为2.6%～5.8%），可满足临床实验室的常规检测要求[19]。LipoScience Corp研制开发的Vantera分析仪及配套的NMR Lipo Profile试剂盒已获FDA批准，可用于脂蛋白颗粒及亚组分的测定[20]。Fernández-Cidón等[21]使用NMR技术进行85例男性患者LDL-P的测定，结果表明NMR技术为AS提供了比传统脂质谱更好的ASCVD风险分层信息。蔺亚晖等[22]进行了NMR技术稳定性的评估，并在1 091例中国人群中进行了血脂谱一致性的比较，结果表明NMR技术检测可获得更丰富的血脂亚类谱。但该法缺点是需特殊实验平台（仪器）、运营成本甚至高于VAP技术，难以在常规临床实验室普及采用。

3 sd LDL-C的测定

通常将密度＞1.034 g/ml，直径为22.0～24.1 nm的LDL称作sdLDL。研究表明，sdLDL比大而轻的LDL更易被氧化，更易促进泡沫细胞形成，是AS斑块发展及心肌梗死的危险因素。Ikezaki等[23]进行了一项包含3 094名受试者的Framingham子代预期 研 究，比 较 血 浆TC、TG、HDL-C、LDL-C、sd LDL-C、LDL-TG、残粒样颗粒脂蛋白胆固醇（remnant-like particles cholesterol，RLP-C）、富含甘油三酯脂蛋白胆固醇 （triglyceride-rich lipoprotein cholesterol，TRL-C）及脂蛋白(a)[Lp(a)]等指标，结果表明sd LDL-C是最易致AS的脂蛋白参数。sd LDL-C水平与冠状动脉狭窄程度、颈动脉内膜中层厚度、内脏脂肪面积、胰岛素抵抗指数等密切相关，有助于ASCVD风险评估及相关疾病的严重程度判断。因此，sd LDL-C作为一种新兴的与ASCVD及其并发症相关的生物标志物，在结合传统血脂分析指标基础上，可考虑将其列为临床常规筛查项目，且需更深入地了解如何控制其水平。对于临床实验室而言，根据所用检测方法建立适当的sd LDL-C参考区间非常必要。目前检测sd LDL-C的方法主要有：高效液相层析法（high performance liquid chromatography，HPLC)、过氧化物酶检测法、凝胶电泳法、NMR技术、计算法、DGUC等。

3.1 HPLC HPLC是一种基于粒度分离的高级脂蛋白分析的参考方法，可进行脂蛋白亚组分包括sd LDL-C在内的颗粒数量测定。HPLC测定sd LDL-C主要有阴离子交换高效液相层析法(AEXHPLC)和凝胶渗透高效液相层析法(GP-HPLC）。Manita等[24]建立了一种基于AEX-HPLC测定sd LDL-C的方法并进行了验证，认为该方法可用于心血管疾病风险的预估和常规临床实验室分析。Toshima等[25]建立了基于GP-HPLC进行高通量脂蛋白谱检测的LipoSEARCHR系统，可进行包括脂蛋白亚组分在内的全套脂蛋白测定，具有所需标本量少、标本类型覆盖范围广、准确和快速等特点。Masuda[26]通过测定404名患者服用降脂药后的脂蛋白亚类水平（包括sd LDL-C），比较了HPLC与F公式法的测量准确性，认为在评估经治疗后患者的LDL-C水平时HPLC更准确，在低LDL-C[＜1.0 mmol/L（40 mg/dl）]患者中，测量值往往高于计算值。

3.2 过氧化物酶检测法 过氧化物酶检测法（也称“直接酶法”）利用聚氧乙烯苄基苯基醚衍生物作为表面活性剂，选择性地与sd LDL-C发生显色反应。此法具有操作简便、易于临床实验室使用等优点，为sd LDL-C的临床常规检测提供了可能。Denka Seiken公司研发的过氧化物酶检测试剂盒是FDA批准的首个sd LDL-C检测试剂，其操作简单，精密度好（批内、批间CV均＜5%），与DGUC具有良好的相关性。Vanavanan等[27]应用直接酶法和PTGE同时测定了242例患者血清sd LDL-C水平，并探讨其在代谢综合征患者ASCVD风险预测方面的差异。结果显示，两种测定方法具有良好的相关性，直接酶法测定的致AS脂蛋白颗粒比PTGE法范围更广，可识别潜在的有血管风险的患者。国内Fan等[28]对市售的七种sd LDL-C直接酶法试剂进行性能验证研究，发现这些商品化试剂盒性能基本能够满足临床检测要求，但试剂之间可比性较差，测定的标准化的问题亟待解决。

4 其它基于LDL的检测项目

4.1 LDL-TG的测定LDL是一种复杂的颗粒混合物，除胆固醇外，其脂类部分主要由磷脂和TG组成。作为一种新的检测项目，LDL-TG有可能成为LDL-C对ASCVD风险预测的补充。Hirano等[29]研究表明，LDL-TG是除LDL-C以外用于预测ASCVD风险的敏感指标，且与全身性炎症的关系密切。但LDL-TG与ASCVD关联的机制尚不清楚，有可能与AS表型相同的现象有关。LDL-TG检测的经典方法包括超速离心法、HPLC和电泳分离法。最近，Ito等[30]开发了一种检测LDL-TG的自动化匀相测定法，其原理与匀相测定法测定LDL-C相似。主要利用两种不同的表面活性剂（1和2），在自动分析仪上直接测定LDL-TG，这种方法与传统DGUC分离LDL之后测定LDL-TG的结果之间有很好的相关性。应用该法测定正常人群LDL-TG中位数为0.09 mmol/L，LDL-TG摩尔含量约为LDL-C含量的5%。目前该方法主要用于科研领域，尚未在临床常规应用。

4.2 LDL-SM的测定 鞘磷脂（SM）是脂蛋白磷脂的主要成分之一,主要存在于富含载脂蛋白B颗粒的VLDL及其分解代谢物LDL中。研究发现,LDLSM在人冠状动脉平滑肌细胞中诱导炎症反应，血清LDL-SM水平较高患者LDL聚集敏感性增加，提示LDL-SM也可能是ASCVD的预测因子[31]。通过使用PCSK9抑制剂或健康饮食诱导的类似成分变化，可降低LDL-SM及LDL聚集敏感性，从而降低ASCVD风险并减缓AS发生发展。LDL-SM的检测主要使用质 谱法 （mass spectrometry，MS）。Ruuth等[32]建立了MS检测血清LDL-SM含量的方法，并用于评估LDL颗粒聚集敏感性及药物和饮食的影响。目前，尚未有可在临床常规实验室开展LDL-SM检测的方法，在LDL-SM测定的方法学及临床应用领域还需做更多的工作。

5 小结

LDL-C作为临床上对ASCVD患者进行管理的重要指标，依赖于临床实验室的准确测定及与临床的良好沟通。随着一些新型高效调脂药物如PCSK9抑制剂等和非禁食样本的逐步使用，临床对LDL-C检测的准确性要求也越来越高，选择更加准确的LDL-C检测方法或开发基于LDL其他成分的检测方法，有益于患者更好地进行降脂治疗、减少相关不良反应。建立包括参考方法、参考物质和标准化计划在内的可靠的参考系统，开发适合各种临床病例（如异常TG水平）的准确、特异、具有自主知识产权的临床检测试剂仍是目前LDL-C研究的热点与难点。尽管我国在LDL-C测定的标准化方面做了大量的工作，匀相测定法检测试剂质量已大幅提高，研发出了可供临床使用的LDL-C冰冻血清国家标准物质，但LDL-C测定的标准化工作仍然面临诸多问题，如研制与实际血清样本行为一致的具有互通性（没有基质效应）的参考物质/质控物质等。sd LDL-C、LDL-P、LDLTG、LDL-SM等几种基于LDL其他成分的新的临床检测项目被开发，极大地丰富了血脂管理在ASCVD防治中的临床应用价值。但这些项目除sd LDL-C外还多处于研究、验证及发展阶段，建立这些新项目测定的参考方法，特别是开发出适合临床实验室常规开展的检测试剂，建立各自合适的参考区间，并在临床推广使用这些新的检验项目，将会为ASCVD的防治提供更多的帮助、助推精准诊治的发展。