高效液相色谱法测定苦木注射液中7种生物碱含量*

赖正权，艾伟鹏，廖慧君，廖祝元，丘金燕，蔡雨峰，杨婷婷，黄裕茵，廖醒环，苏子仁

[1.深圳大学总医院药学部，深圳 518055；2.华中科技大学协和深圳医院(深圳大学第六附属医院)药学部，深圳 518052；3.江西青峰药业有限公司，赣州 341000；4.广州中医药大学，中医药数理工程研究院，广州 510006]

苦木注射液收载于《中华人民共和国卫生部药品标准·中药成方制剂》第二十册，为苦木干燥枝或茎经加工制成。其原料苦木[Picrasmaquassioides(D.Don)Benn]为苦木科(Simaroubaceae)苦木属植物，具有清热、解毒、消炎的功效，用于感冒、上呼吸道感染、急性扁桃体炎、肠炎、细菌性痢疾等[1]。现代化学研究表明，苦木含有生物碱、苦味素、三萜类和挥发油类等化学成分，其中生物碱及苦味素为其主要的药效成分[2-12]，具有抗菌消炎、解热降压、抗肿瘤、抗蛇毒和抗疟等作用[13-16]。

部颁标准中对苦木注射液的质量控制方法仅有薄层色谱法及重量法，质量控制方法有待提高。有文献报道采用高效液相色谱法单独测定苦木注射液中铁屎米酮类或咔巴啉类生物碱的含量[17-18]，其标准多侧重于测定苦木注射液中同类母核结构成分的含量，而同时测定多个母核结构成分的方法尚未见报道。为确保该品种的质量稳定、可控，本实验建立HPLC法同时测定苦木注射液中铁屎米酮类和咔巴啉类共7个生物碱含量的分析方法，可为该品种质量控制体系的建立提供实验依据。

1 仪器与试药

1.1仪器 岛津高效液相色谱仪(SPD-M20A PDA检测器、CTO-20A柱温箱、SIL-20AC自动进样器、LC-20AT泵、LC solution色谱工作站，日本岛津公司)；试验室专用超纯水机(重庆利迪现代水技术设备有限公司)；BSA224S-SW 电子天平(感量：0.1 mg，德国Sartorius公司)；CP225D电子天平(感量：0.01 mg，德国Sartorius公司)。

1.2试药 对照品1-甲酸-6-羟基-β-咔巴啉(a)，1-甲酸-β-咔巴啉(b)，1-丙酸基-β-咔巴啉(c)，3-甲基-铁屎米-5，6-二酮(d)，3-甲基-4-甲氧基-铁屎米-5，6-二酮(e)，4-甲氧基-5-羟基铁屎米酮(f)，4，5-二甲氧基-铁屎米酮(g)由广州中医药大学新药开发研究中心从苦木[Picrasmaquassioides(D.Don)Benn.]的茎中分离得到，并经四大光谱确定结构式，HPLC归一法测定纯度>98%，可供对照用，化学结构式见图1。苦木注射液由青峰药业有限公司提供。甲醇为色谱纯(Merck公司)，水为重蒸水，其余试剂均为分析纯。

图1 7个生物碱的化学结构式

2 方法与结果

2.1混合对照品溶液的制备 分别取1-甲酸-6-羟基-β-咔巴啉、1-甲酸-β-咔巴啉、1-丙酸基-β-咔巴啉、3-甲基-铁屎米-5、6-二酮、3-甲基-4-甲氧基-铁屎米-5、6-二酮、4-甲氧基-5-羟基铁屎米酮、4，5-二甲氧基-铁屎米酮对照品适量，精密称定，加甲醇制成浓度分别为30，153，22.8，11.4，7.2，12，3 μg·mL-1对照品储备溶液。4 ℃保存、备用。临用前，用甲醇按照1，2/3，1/2，1/3，1/6和1/30的比例稀释对照品储备溶液，过0.45 μm微孔滤膜，即得。

2.2供试品溶液的制备 取适量苦木注射液，过孔径0.45 μm微孔滤膜，即得。

2.3色谱条件 色谱柱为Phenomenex Gemini C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相30 mmol·L-1乙酸铵(冰乙酸调pH值4.5)溶液(A)-甲醇(B)梯度洗脱(0～6 min，5%→6% B；6～9 min，6%→20% B；9～30 min，20%→23% B；30～40 min，23%→30% B；40～50 min，30%→36% B；50～75 min，36%→65% B；75～80 min，65%→5% B；80～85 min，5% B)；流速1.0 mL·min-1；柱温30 ℃；进样量10 μL；检测波长254 nm。结果化合物a、b、c、d、e、f、g均能达到基线分离，样品中其他成分对测定无干扰，见图2。

a.1-甲酸-6-羟基-β-咔巴啉；b.1-甲酸-β-咔巴啉；c.1-丙酸基-β-咔巴啉；d.3-甲基-铁屎米-5，6-二酮；e.3-甲基-4-甲氧基-铁屎米-5，6-二酮；f.4-甲氧基-5-羟基铁屎米酮，g.4，5-二甲氧基-铁屎米酮。

2.4线性关系考察 精密吸取混合对照品溶液，按“2.1”项下方法分别配制成6个不同质量浓度的对照品溶液，按“2.3”项下色谱条件进行测定。以峰面积为纵坐标(Y)，对照品质量浓度为横坐标(X)，绘制标准曲线。结果见表1，线性相关系数均>0.999 0，表明线性关系良好。

表1 7个生物碱的线性回归方程和线性范围

2.5精密度试验 取同一份混合对照品溶液(浓度：1/3倍储备溶液浓度)，按“2.3”项下色谱条件连续进样6次，结果1-甲酸-6-羟基-β-咔巴啉，1-甲酸-β-咔巴啉，1-丙酸基-β-咔巴啉，3-甲基-铁屎米-5，6-二酮，3-甲基-4-甲氧基-铁屎米-5，6-二酮，4-甲氧基-5-羟基铁屎米酮和4，5-二甲氧基-铁屎米酮峰面积的RSD分别为0.2%，0.3%，0.1%，1.0%，0.9%，0.5%和0.9%。表明仪器精密度良好。

2.6稳定性试验 取同一批号苦木注射液(批号：181016)，按“2.2”项下方法制备样品，在室温下放置0，4，8，12，24，48 h时，分别按“2.3”项下色谱方法进样测定，记录各对照品的峰面积。结果1-甲酸-6-羟基-β-咔巴啉、1-甲酸-β-咔巴啉、1-丙酸基-β-咔巴啉、3-甲基-铁屎米-5，6-二酮、3-甲基-4-甲氧基-铁屎米-5，6-二酮、4-甲氧基-5-羟基铁屎米酮和4，5-二甲氧基-铁屎米酮峰面积的RSD分别为0.5%，0.7%，0.6%，1.2%，1.8%，0.5%和0.3%。表明供试品溶液在48 h内稳定。

2.7重复性试验 取同一批号苦木注射液(批号：181016)6份，按照“2.2”项下方法制备样品，按“2.3”项下色谱方法依次进样，分别测定7个生物碱的含量。结果1-甲酸-6-羟基-β-咔巴啉、1-甲酸-β-咔巴啉、1-丙酸基-β-咔巴啉、3-甲基-铁屎米-5，6-二酮、3-甲基-4-甲氧基-铁屎米-5，6-二酮、4-甲氧基-5-羟基铁屎米酮和4，5-二甲氧基-铁屎米酮的平均含量分别为19.14，65.02，11.09，4.89，1.83，4.52，2.03 mg·L-1；RSD分别为0.8%，1.3%，0.4%，1.7%，2.1%，0.7%和0.5%。表明测定方法的重复性良好。

2.8加样回收率试验 量取已测含量的苦木注射液(批号：181016)2 500 μL共6份，分别置5 mL量瓶中，准确加入与样品中含量等量的对照品溶液，加甲醇定容至刻度。按“2.2”项下方法同法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件测定，记录色谱图，计算回收率，结果见表2。1-甲酸-6-羟基-β-咔巴啉、1-甲酸-β-咔巴啉、1-丙酸基-β-咔巴啉、3-甲基-铁屎米-5，6-二酮、3-甲基-4-甲氧基-铁屎米-5，6-二酮、4-甲氧基-5-羟基铁屎米酮和4，5-二甲氧基-铁屎米酮的平均回收率分别为100.19%，100.23%，99.22%，100.51%，101.65%，99.69%，101.17%；RSD分别为1.05%，2.12%，0.91%，2.21%，0.97%，0.82%，1.38%。表明本方法符合分析方法学要求。

表2 7个生物碱的加样回收率试验结果

2.9样品测定 取不同批次苦木注射液样品，分别按“2.2”项下方法制备样品，按“2.3”项下色谱方法分别进样，测定7个生物碱的峰面积，计算含量，结果见表3。

表3 苦木注射液中7个生物碱的含量测定

3 讨论

3.1流动相的选择 苦木注射液的主要成分是生物碱类成分，笔者在本实验考察了不同流动相系统(A：甲醇-乙酸铵溶液系统；B：甲醇-磷酸盐缓冲溶液系统；C：甲醇-十二烷基苯磺酸钠水溶液系统；D：甲醇-氨水系统)，结果发现以A系统分离度、峰形及理论塔板数较好。同时为了优化A系统的色谱条件，考察了流动相中不同pH值(3.5，4.0，4.5和5.0)、不同乙酸铵浓度(20，25，30，35 mmol·L-1)，最终优选了pH值4.5，乙酸铵浓度30 mmol·L-1。

3.2色谱柱的选择 通过对比五个不同品牌的色谱柱：Phenomenex Luna C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Phenomenex Gemini C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、YMC Pack ODS(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Agilent Zorbax SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Waters SymmetryShield RP18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，结果发现Luna、Gemini色谱柱柱效较好，最后选用pH值适应范围宽的Gemini色谱柱。

3.3指标成分的选择 本研究选择了7个生物碱成分作为指标，建立了HPLC法同时测定7种生物碱含量的分析方法，经系统的方法学考察，结果此法重现性好、操作简便、准确性高。其中化合物3-甲基-4-甲氧基-铁屎米-5，6-二酮首次被选为指标性成分，用于苦木注射液的质量评价。

3.4测定结果分析 无质量监控的同一厂家10批次产品中7个生物碱含量波动较大，7个生物碱总含量差异也大，提示加强指标成分的质量监控，有利苦木注射液的质量稳定。产品的质量与原料质量、生产工艺密切相关，要提高产品质量，不但要监控原料的质量，而且还要优化、稳定生产工艺。