鸭疫里默氏杆菌病和鸭圆环病毒病混合感染的实验室诊断

袁林，张海，邓珊珊，蔺俐仲，袁标，罗登荞，景书灏，徐春志，杨源，刘艳

（1.贵阳市息烽县农业农村局 551100；2.贵阳市动物疫病预防控制中心 550081；3.贵阳市清镇市农业农村局 551400；4.贵阳市草地站 550081）

近年来贵州大力发展生态家禽养殖业，但是由于养殖业的快速发展和养殖密度的增大，养鸭场常常发生各类疫病，其中鸭疫里默氏杆菌病和鸭圆环病毒， 已成为危害养鸭产业发展的重要疾病之一。 鸭疫里默氏杆菌病是由鸭疫里默氏杆菌引起的急性、败血性、接触性传染病，又称为鸭传染性浆膜病。 主要临床特征为纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎，易感动物有鸡、鸭、火鸡等，其中对2～3 周龄雏鸭的最易感染。 该病自1904 年首次报道鸭疫里默氏杆菌，随后在世界各国相继发生。 鸭圆环病毒属于圆环病毒科、圆环病毒属，是目前已知最小的鸭病毒。 2020 年5 月贵州省某鸭场购进6 日龄雏鸭5000 只， 饲养至10 日龄时开始逐渐发病并有大量的雏鸭死亡， 雏鸭15 日龄时已死亡1000 余只。 病鸭临床症状为病鸭被毛散乱、行动迟缓、站立不稳、精神沉郁等，部分患鸭头颈歪斜、卧地不起。 剖检病死鸭可见脑组织水肿、病鸭脾脏肿大、附关节肿大等大体病变。 为进一步确诊该养鸭场雏鸭异常死亡的病因， 采用了细菌分离鉴定、PCR 检测、药敏试验和病毒核酸检测等实验室诊断方法， 为后期防控提供参考。

1 材料和方法

1.1 病料

选择患病雏鸭5 只，无菌采集心包液、肝脏组织、脑组织样本。

1.2 主要试剂和培养基

2×TaqPCRMasterMix、DNAMarkerDL2000、细菌基因组提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；DNA 提取试剂盒、RNA 提取试剂盒、 禽流感病毒通用型核酸检测试剂盒和新城疫病毒核酸检测试剂盒均购自北京世纪元享公司；新生牛血清，购于浙江天杭生物科技有限公司；试验所用的抗菌药敏纸片，购自杭州微生物试剂有限公司；巧克力培养基实验室自制。

1.3 细菌分离培养

分别无菌接种5 只受检鸭的心包液、 肝脏组织于巧克力琼脂平板，置于烛缸中37℃恒温厌氧培养24h。

1.4 细菌PCR 检测

挑取纯化培养的单个菌落到5%新生牛血清的液体培养物中，震荡过夜培养。 参照细菌基因组提取试剂盒说明书提取细菌总DNA。 根据鸭疫里默氏杆菌外膜蛋白A(OmpA)基因设计特异性引物， 预扩增片段663bp； 鸭圆环病毒特异性引物目的片段338bp。 扩增产物进行电泳检测，观察是否有特异性目的条带。

1.5 细菌药敏试验

药敏试验采用药敏纸片琼脂扩散法， 参照美国临床实验室标准化协会（ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute,CLSI）制定的标准进行，药敏结果判断标准按NCCLS2010 年标准，作出结果判断。

1.6 病毒核酸检测

取患鸭内脏及脑组织样本，加入适量PBS 缓冲液，研磨匀浆后， 离心取上清， 采用RNA/DNA 提取试剂盒分别提取病毒RNA/DNA， 进行禽流感病毒、 新城疫病毒和鸭圆环病毒核酸检测。

2 结果

2.1 细菌分离培养及形态

经37℃无氧过夜培养的巧克力琼脂平板， 生长出表面光滑湿润、边缘整齐、半透明露滴状菌落。 挑取单个菌落进行纯培养，经革兰氏染色，镜检显示分离菌为革兰氏阴性短小杆菌。 初步判断为鸭疫里默氏杆菌。

2.2 细菌PCR 鉴定

取PCR 扩增产物8μL， 于1.2%琼脂糖凝胶上进行电泳，凝胶成像系统观察， 结果显示鸭疫里默氏杆菌阳性对照和分离菌样本在663bp 处均出现特异性条带，结果见图1，可得本次厌氧分离得到的细菌为鸭疫里默氏杆菌。

图1 分离菌PCR 扩增结果

2.3 细菌药敏试验

对分离得到的鸭疫里默氏杆菌分离株进行药敏试验， 结果为分离菌对头孢拉定、头孢他啶、头孢氨苄、头孢哌酮等抗菌药物呈现良好的敏感性。

2.4 病毒核酸检测结果

对5 份病料组织进行禽流感病毒、 新城疫病毒和鸭圆环病毒核酸检测，其中行禽流感病毒、新城疫病毒核酸检测为阴性，5份样本均扩增出与鸭圆环病毒预期相符的目的片段（图2）。提示鸭群存在鸭圆环病毒感染。

图2 鸭圆环病毒PCR 扩增结果

3 结论

采用细菌分离鉴定、PCR 检测、 药敏试验和病毒核酸检测等实验室诊断方法， 确诊该养鸭场雏鸭异常死亡的病因为鸭疫里默氏杆菌和鸭圆环病毒混合感染。 药敏试验发现，分离菌对对头孢拉定、头孢他啶、头孢氨苄、头孢哌酮等抗菌药物呈现良好的敏感性。

4 讨论

鸭圆环病毒病是免疫抑制病，感染可造成鸭淋巴组织损伤，导致鸭机体体液免疫和细胞免疫功能下降， 这种免疫抑制反应增强了其他共感染因素的致病性。 鸭圆环病毒常常与其他细菌性疾病和病毒性疾病混合感染，其中与大肠杆菌、鸭疫里默氏杆菌、鸭坦布苏病毒、副黏病毒等的混合感染率较高。

鸭疫里默氏杆菌在国内流行的血清型是1 型和2 型， 其他的10 种血清型也常伴随发生。 疫苗免疫是预防鸭疫里默氏杆菌病的重要的手段和方法，但是由于血清型较多，且不同血清型之间交叉免疫效果不好。 养鸭场一旦发病，在临床上主要采用抗生素药物进行治疗，但是由于大量抗生素药物的滥用，造成了不同程度的耐药。 因此选择合适的敏感药物，对治疗和预防鸭疫里默氏杆菌病显得至关重要。

由于目前针对鸭圆环病毒病和鸭疫里默氏杆菌病没有有效的疫苗和药物，要做好防控工作，首先必须做好引种检疫和合群前隔离，加强养殖场生物安全体系建设和饲养管理水平；加强环境卫生清洁和消毒，注意交替使用消毒药物，避免产生耐药性影响消毒效果；有效提高鸭群免疫力，切断传播途径；同时养殖场也荧光积极开展鸭群疫病净化工作；做好禽流感、新城疫等疫病的基础免疫工作并加强免疫抗体监测。