碳纤维电离质谱快速分析中药中挥发性成分

张 强，苏 越，郭寅龙

(1.河南警察学院刑事科学技术系，河南 郑州 450046；2.上海中医药大学交叉科学研究院，中医方证与系统生物学研究中心，上海 201203；3.中国科学院上海有机化学研究所，上海有机质谱中心，上海 200032)

大多数中药中含有挥发性成分，如烯萜类、酯类、醛类、酮类等。这些挥发性成分具有抗肿瘤[1]、抗病毒[2]、抗菌[3-4]、抗氧化[5-6]、辅助睡眠[7]、解热镇痛、止咳平喘、驱虫、抑制中枢神经等生物活性。由于中药中挥发性成分具有低极性、易挥发的特性，目前多采用气相色谱-质谱(GC-MS)法对其进行分析。GC-MS所使用的电子轰击电离源(EI)通常需要200 ℃以上的高温[8]，对于一些中等极性及热不稳定的化合物，例如，酯、酚、不饱和脂肪酸等，高温会促使其分解，仪器捕获到的主要是裂解后小分子产物的化学信息，无法获取样品原始真实的结构信息。

敞开式离子化质谱(AIMS)能以最少的样品前处理，在常压环境下快速直接地对复杂样品进行分析[9]，最大限度地避免了对样品的破坏和化学污染的引入，已广泛应用于中药分析领域[10-15]。近年来，AIMS分析中不断地引入新材料，例如：石墨[16]、碳纳米管[17-18]、碳纳米管纸[19-20]、碳纤维[21-23]等。碳纤维是一种新型功能性材料，具有优异的吸附性，兼具一定的导电性，无需气体辅助，只需加上高电压就可以对其吸附的样品进行快速直接离子化[24-25]。碳纤维电离质谱(CFI-MS)已被应用于多种类型化合物的分析[26-27]。碳纤维上的残留物可用火烧法迅速除去，不需要繁琐的净化处理，可以实现快速直接检测。CFI-MS可以兼容不同极性溶剂，无需辅助溶剂即可进行直接分析。与其他AIMS相比，CFI-MS装置简单、成本低廉、易于操作、调节参数较少，在高通量分析时更加快速高效、省时省力[24,28]。

本研究拟以桂枝、当归、川芎、广藿香油、复方川芎胶囊和四物颗粒为例，对样品不做任何前处理，在敞开的常压环境下，采用CFI-MS法直接分析这些中药中多种挥发性成分并进行MS/MS鉴定。此外，对不同新鲜程度的桂枝和橘皮进行快速分析，通过质谱图的差异探讨中药新鲜程度的鉴别方法。

1 实验部分

1.1 主要仪器与设备

TSQ Quantum Access三重四极杆质谱仪：美国Thermo Fisher公司产品，配有Xcalibur2.2数据处理系统；直流高压电源：波尔高压电源有限公司产品；超声波清洗器：昆山超声波仪器有限公司产品；Milli-Q Advantage A10净水系统：美国Millipore公司产品；0.45 μm针头式过滤器：安谱科技有限公司产品；Torayca®type T300B-3000碳纤维：日本TORAY Industries公司产品。

1.2 主要材料与试剂

甲醇：色谱纯，德国Merck公司产品；桂皮醛标准品：百灵威科技有限公司产品；广藿香油：上海麦克林生化科技有限公司产品；复方川芎胶囊：山东凤凰制药股份有限公司产品；四物颗粒：吉泰安(四川)药业有限公司产品。

当归：产地甘肃，购于上海康桥中药饮片有限公司；新鲜切片的桂枝(3个批次)：于采收季购于广西，并敞开放置一年后，备用；新鲜橘皮(3个批次)：产自浙江省台州市涌泉镇的芸香科植物橘(Citrus reticulata Blanco)的成熟果皮，陈皮由上述新鲜橘皮晒干制得。

1.3 实验条件

所有实验均在TSQ Quantum Access三重四极杆质谱仪上进行，采用Xcalibur2.2软件进行数据采集和分析。质谱基本参数：离子源真空4.8×10-4Pa，离子传输管温度275 ℃；MS/MS分析时，碰撞气为氩气(34.5 kPa)，碰撞能0～45 eV。

1.4 样品制备

将桂皮醛标准品溶解于甲醇中，制成10 mg/L的溶液，备用。

对于中药材和中药制剂，不经过任何前处理，直接放置在碳纤维下方进行分析。

1.5 CFI-MS分析

CFI-MS直接分析中药样品的示意图示于图1。碳纤维水平放置于质谱入口前，与质谱入口在同一轴线上。碳纤维尖端和质谱入口间的距离为D。未经前处理的样品直接放置于碳纤维尖端正下方，样品和碳纤维尖端的垂直距离为d。

图1 CFI-MS分析示意图Fig.1 Schematic of CFI-MS analysis

2 结果与讨论

2.1 CFI-MS质谱条件优化

配制桂皮醛甲醇溶液用以模拟中药挥发性药材，对影响CFI-MS分析性能的3个主要因素——碳纤维上施加的电压(HV)、碳纤维尖端与质谱入口间的距离(D)、样品与碳纤维尖端的距离(d)进行优化，以桂皮醛的[M+H]+(m/z133)质谱信号强度为考察指标，控制单一变量，结果示于图2。

由图2a可见，在低电压时，随电压的增大，桂皮醛的[M+H]+信号强度增大，当电压达到2.0 kV时，离子信号强度达到最大值，且保持稳定，此时若继续增大电压则会导致放电现象，因此选取电压值为2.0 kV。图2b显示，随距离D的增大，桂皮醛的[M+H]+信号峰强度降低，距离越短强度越高，当距离小于2 mm时，极易发生放电现象，因此最终选择D=2 mm。图2c显示，随距离d的增大，桂皮醛的[M+H]+信号峰强度降低，当距离小于5 mm时，中药饮片上的粉末颗粒会被吸入质谱仪而造成仪器污染，因此最终选择d=5 mm的安全距离。负离子模式下的分析也具有相同的趋势，因此不再给出具体数据。

图2 不同HV(a)、距离D(b)、距离d(c)下，桂皮醛的质谱信号强度(n=3)Fig.2 Signal intensity of cinnamaldehyde at different HV (a), distance D (b), distance d (c) (n=3)

采用优化的CFI-MS方法对桂皮醛标准溶液(10 mg/L)进行分析，质谱图示于图3。

为考察CFI-MS对低浓度样品的质谱响应，配制浓度分别为10、1.0×102、1.0×103、1.0×104和1.0×105μg/L的桂皮醛甲醇溶液进行CFI-MS分析，结果示于图4。以桂皮醛[M+H]+质谱信号的绝对强度为纵坐标，浓度的对数为横坐标，重复测定3次。随着样品浓度的不断增加，m/z133的质谱信号强度逐渐增强，这表明CFI-MS可用于挥发性成分的分析，且离子信号的强度与样品浓度呈正相关。

图3 桂皮醛CFI-MS(a)和CFI-MS/MS(b)谱图Fig.3 CFI-MS (a) and CFI-MS/MS (b) spectra of cinnamaldehyde

注：n=3，[M0]为1.0 μg/L图4 桂皮醛质谱信号强度与浓度之间的关系Fig.4 Relationship between signal intensity and concentration of cinnamaldehyde

最终确定的实验条件：HV为2.0 kV，距离D为2 mm，距离d为5 mm。10 μg/L的桂皮醛溶液能得到高质量的CFI-MS谱图，该结果表明，CFI-MS具有较高的灵敏度。

2.2 CFI-MS快速直接分析多种中药的挥发性成分

2.2.1CFI-MS快速直接分析中药饮片 选取桂枝和当归饮片作为研究对象，采用2.1节优化的CFI-MS条件，对饮片中的主要挥发性成分进行快速直接分析，实验结果示于图5。经查阅相关文献并进行CFI-MS/MS验证，可知图5a中m/z133与文献[29-30]报道的桂枝中桂皮醛(cinnamaldehyde，C9H8O)的[M+H]+一致。图5c中m/z191与文献报道[29-30]的当归中藁本内酯(ligustilide，C12H14O2)的[M+H]+一致。

采用不同的碰撞能量值进行CFI-MS/MS分析，可以确定图5c中m/z208的质谱信号为藁本内酯的[M+NH4]+，m/z381的质谱信号为藁本内酯的[2M+H]+，其CFI-MS/MS分析结果示于附图1。(因篇幅所限，请登录《质谱学报》官方网站http:∥www.jcmss.com.cn下载，以下同)

对川芎饮片进行CFI-MS分析，结果示于图6，其挥发性成分的CFI-MS/MS图示于图7。经查阅相关文献并进行CFI-MS/MS验证，可知m/z191、193、195分别与文献报道[31-35]中藁本内酯、洋川芎内酯A(3-N-butyl-4,5-dihydrophthalide，C12H16O2)、蛇床内酯(neocnidilide，C12H18O2)的[M+H]+一致。

注：a.桂枝的CFI-MS图；b. m/z 133的CFI-MS/MS图；c.当归的CFI-MS图；d. m/z 191的CFI-MS/MS图图5 CFI-MS快速直接分析中药饮片的挥发性成分Fig.5 CFI-MS spectra of volatile components in traditional Chinese medicine

图6 川芎的CFI-MS图Fig.6 CFI-MS spectrum of Ligusticum chuanxiong

2.2.2CFI-MS快速直接分析中药制剂 以配方中含有当归和川芎的中药复方制剂——四物颗粒(当归、川芎、白芍、熟地黄)和复方川芎胶囊(川芎和当归)为检测对象，利用CFI-MS分析其中的主要挥发性成分，结果示于图8。图8中均出现藁本内酯的m/z191信号。图8b中，m/z141的质谱信号经CFI-MS/MS验证，示于图9，认为其可能是添加剂乙基麦芽酚(ethyl maltol，C7H8O3)的[M+H]+。

在正、负离子模式下，采用CFI-MS法分析藿香油，结果示于图10。图10a中的离子信号经参考相关文献[36]和CFI-MS/MS验证，鉴定其分别是烃类、萜类、酮类、酯类等成分，图谱示于附图2，详情列于表1。图10b中的离子信号经参考相关文献[36-38]和CFI-MS/MS验证，图谱示于附图3，其可能含有的化合物列于表2。其中，m/z223为广藿香油中的主要成分广藿香酮(pogostone，C12H16O4)的[M-H]-，m/z209和m/z253分别是酯类和甾体类成分。

2.3 CFI-MS在中药新鲜程度鉴别中的应用

采用CFI-MS方法快速直接分析不同新鲜程度的中药材，尝试探索CFI-MS在中药质量控制和评价研究中的应用价值。

分别对新鲜切片的桂枝和长期在敞开环境中放置的桂枝进行CFI-MS分析，结果示于图11。可见，图11b中背景噪声比图11a更高，图11b中m/z133(桂皮醛的[M+H]+)的信号强度比图11a中低2～3个数量级。分别对另外两个批次的新鲜切片桂枝和长期在敞开环境中放置的桂枝进行分析，得到了类似结果，因此认为长期在敞开环境中放置的桂枝中桂皮醛流失比较严重。第二年采购了另外一批药材，重复以上实验，得到了一致的实验结果。据此证明了信号强度变化不是由仪器引起的，而是由药材放置时间导致的。

图7 川芎中挥发性成分的CFI-MS/MS图Fig.7 CFI-MS/MS spectra of volatile components in Ligusticum chuanxiong

图8 正离子模式下，复方川芎胶囊(a)和四物颗粒(b)的CFI-MS图Fig.8 CFI-MS spectra of Fufangchuanxiong capsules (a) and Siwu granules (b) at positive ion mode

图9 四物颗粒中m/z 141的CFI-MS/MS图Fig.9 CFI-MS/MS spectrum of m/z 141 in Siwu granules

对陈皮和新鲜橘皮进行CFI-MS分析，结果示于图12。经CFI-MS/MS验证，m/z137与文献[39-41]中柠檬烯(limonene，C10H16)的[M+H]+一致，m/z273与文献[42]中柚皮素(naringenin，C15H12O5)的[M+H]+一致，m/z205与文献[43]中反式石竹烯(β-caryophyllen，C15H24)的[M+H]+一致，谱图示于附图4。

图10 正离子(a)和负离子(b)模式下，广藿香油的CFI-MS图Fig.10 CFI-MS spectra of patchouli oil at positive ion mode (a) and negative ion mode (b)

表1 正离子模式下，广藿香油的质谱信号及其可能的化合物Table 1 Mass spectral signals of patchouli oil and its possible compounds at positive ion mode

表2 负离子模式下，CFI-MS分析广藿香油捕获的质谱信号及其可能的化合物Table 2 Mass spectral signals of patchouli oil and its possible compounds at negative ion mode

图11 新鲜切片桂枝(a)和长期在敞开环境中放置桂枝(b)的CFI-MS图Fig.11 CFI-MS spectra of fresh sliced Ramulus Cinnamomi (a) and Ramulus Cinnamomi placed for a long time in an open environment (b)

图12 新鲜橘皮(a)和陈皮(b)的CFI-MS图Fig.12 CFI-MS spectra of fresh tangerine peel (a) and dried tangerine peel (b)

未鉴定出m/z341，但其也是橘皮中某个成分的质谱信号[43]。比较新鲜橘皮和陈皮的谱图发现，图12b中m/z137、m/z273的信号强度比图12a中的信号强度低1个数量级，图12a中m/z205、m/z341的信号在图12b中消失。对另外两个批次的新鲜橘皮和陈皮进行分析，得到了类似的结果。因此，认为中药在炮制过程中某些成分，特别是挥发性成分，容易流失。

3 结论

本研究利用CFI-MS方法快速直接分析未经前处理的桂枝、当归、川芎、广藿香油、复方川芎胶囊和四物颗粒的挥发性成分，并成功的表征烃类、萜类、醛类、酮类、酚类、酯类、甾体类等。利用CFI-MS对长期在敞开环境中放置的桂枝和新切片桂枝，陈皮和新鲜橘皮进行直接分析，实现了不同新鲜程度中药的快速鉴别。结果表明，利用CFI-MS分析中药挥发性成分时，无需破坏样品，无需控温设备，可以原位、快速、直接分析，更适用于中药质量控制的快速筛查。与其他AI-MS相比，CFI-MS装置简单、易操作、调节参数少，在直接分析时快速高效、省时省力。CFI-MS除了能对中药中挥发性成分进行系统表征，还能通过监测一些代表性挥发性成分的信号强度，初步鉴别中药的新鲜程度，进而为其药效物质基础及质量控制研究提供理论依据。但是，还需要对更多种中药中挥发性成分进行研究，以考察该方法的普适性。