GC-MS/MS法测定乳油和可溶液剂型液体农药制剂中3种高风险吡咯烷酮类农药助剂

唐祥凯，冯德建，李怀平，史谢飞，许 洋，陈 璐，吴 微

(中国测试技术研究院，茶叶标准与检测技术四川省重点实验室，四川 成都 610021)

吡咯烷酮类有机溶剂，如N-甲基吡咯烷酮(NMP)、1-乙基-2-吡咯烷酮(NEP)和2-吡咯烷酮(PYR)等溶解性好、热稳定性和化学稳定性均佳，且具有黏度低、无腐蚀、挥发性低和可生物降解等优点，被广泛应用于锂电、医药、农药、颜料、清洗剂、绝缘材料等行业[1-3]。在液体型农药制剂生产中，吡咯烷酮类有机溶剂主要用作溶剂或助溶剂，根据农药剂型及有效成分的不同，含量在1%～99%之间不等[4-5]。已有研究表明[6-7]，吡咯烷酮类农药助剂具有致癌性、致畸性、致突变性、干扰内分泌、繁殖损伤等风险，鉴于此，各个国家对吡咯烷酮类农药助剂制定了严格的管理规定或标准。2014年，美国环保署(EPA)将NEP从可使用农药助剂清单(即正面助剂清单)中删除[8]；2012年，西班牙公布的植物保护产品中将NMP、NEP、PYR列入不可接受的助剂名单[9]；印尼规定家用农药中NMP含量不得大于25 mg/kg[10]。我国农药助剂管理工作起步较晚，2015年7月，原农业部农药检定所发布了《农药助剂禁限用名单》的征求意见稿，拟规定农药制剂中NMP、NEP、PYR含量不得超过5%，但至今未正式出台。这些有害助剂在农药施用过程中全部进入环境，并长时间残留在大气圈、水圈等循环系统中，不仅污染环境，而且危害人畜安全，其毒害作用不低于甚至远大于农药有效成分本身[11]。

目前，对于农药制剂中吡咯烷酮类助剂的检测仅有气相色谱-质谱联用法[3,12-13]，未见采用气相色谱-串联质谱(GC-MS/MS)法同时测定NMP、NEP、 PYR 3种农药助剂的报道。与传统的单四极杆质谱相比，串联质谱的多反应监测(MRM)模式具有更强的抗基质干扰能力和定性、定量准确性，且灵敏度更高，适合复杂基质样品的成分分析。

本研究选取具有代表性的乳油和可溶液剂型农药制剂为研究对象，拟建立GC-MS/MS法同时测定乳油和可溶液剂型液体农药制剂中3种高风险吡咯烷酮类农药助剂，并考察方法的溶剂效应、基质效应、准确度和精密度，旨用于实际农药制剂样品的分析。

1 实验部分

1.1 仪器与装置

7890B-7000C型气相色谱-串联质谱联用仪(配有电子轰击源(EI)，G4567A 自动进样器和Mass Hunter工作站)、VF-WAXms毛细管色谱柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)：美国Agilent公司产品；5810R型高速冷冻离心机：德国Eppendorf公司产品；BP 211D型电子天平：德国Sartorius公司产品。

1.2 材料与试剂

甲醇：色谱纯，美国Sigma-Aldrich公司产品；N-甲基吡咯烷酮：分析纯，成都市科隆化学品有限公司产品；1-乙基-2-吡咯烷酮：分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司产品；2-吡咯烷酮：分析纯，成都市科龙化工试剂厂产品。

联苯菊酯(25 g/L乳油)、啶虫脒(5%乳油)、高效氯氟氰菊酯(2.5%乳油)、氟啶脲(50 g/L乳油)、丁子香酚(0.3%可溶液剂)、桉油精(5%可溶液剂)、藜芦碱(0.5%可溶液剂)、春雷霉素(2%可溶液剂)等市售农药制剂样品：购自四川农业高新技术产品综合市场。

对照品单标储备溶液的配制：分别称取9.64 mgN-甲基吡咯烷酮，9.48 mg 1-乙基-2-吡咯烷酮和9.32 mg 2-吡咯烷酮于10 mL容量瓶中，以甲醇为溶剂，配制成对照品单标储备溶液，于4 ℃避光保存。

对照品混合标准储备溶液的配制：准确称取适量N-甲基吡咯烷酮、1-乙基-2-吡咯烷酮和2-吡咯烷酮(精确至0.01 mg)于100 mL容量瓶中，以甲醇为溶剂，配制成5 000 mg/L对照品混合标准储备溶液，4 ℃避光保存。

对照品混合标准工作溶液的配制：精确吸取适量对照品混合标准储备溶液，以甲醇为溶剂，配制成不同质量浓度的系列标准工作溶液，现配现用。

1.3 样品前处理

称取0.1 g农药制剂样品(精确至0.000 1 g)于10 mL容量瓶中，加入5 mL甲醇溶液，涡旋振荡提取2 min，用甲醇定容至刻度，混匀，吸取5 mL提取液，于20 ℃下以8 000 r/min离心5 min，取上清液，过0.22 μm尼龙滤膜，待GC-MS/MS分析。提取时，根据样品中农药助剂的含量适当调整提取溶剂用量。

1.4 实验条件

1.4.1色谱条件 Agilent VF-WAXms毛细管色谱柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)；升温程序：60 ℃保持2 min，以10 ℃/min升温至150 ℃，再以25 ℃/min升温至230 ℃，保持25 min；进样口温度230 ℃，分流进样(分流比50∶1)，进样量1 μL；载气：氦气(≥99.999%)，恒流模式，流速1.0 mL/min。

1.4.2质谱条件 电子轰击离子源，电子能量70 eV；离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；传输线温度230 ℃；碰撞气：氮气(≥99.999%)，流速1.5 mL/min；淬灭气：氦气(≥99.999%)，流速2.25 mL/min；溶剂延迟10.0 min；多反应监测(MRM)模式。3种农药助剂的保留时间和特征离子列于表1。

表1 3种吡咯烷酮类农药助剂名称、CAS号、GC-MS/MS参数Table 1 Chemical abstract service (CAS) numbers and GC-MS/MS parameters of three pyrrolidone pesticide adjuvants

2 结果与讨论

2.1 溶剂选择

由于农药制剂中含有的有效成分等其他物质会对农药助剂成分的分离和检测造成一定干扰，因此在检测农药助剂时，样品需溶解和稀释后才能进行分析。助剂分析常用的溶剂有甲醇[13-14]、乙腈[15-16]、丙酮[12,17]和乙酸乙酯[18-19]等，本实验分别用4种溶剂配制20.0 mg/L混合标准溶液，在同一条件下进行6次重复测定，通过对比目标化合物在相同浓度下的响应值以考察溶剂效应，结果示于图1。由图1可知，采用甲醇配制标准溶液时，3种助剂响应值最高。综合考虑提取溶剂的溶解性、挥发性、毒性以及与目标物的分离度后，最终选择甲醇作为提取和稀释溶剂。

注：EC表示乳油；SL表示可溶液剂图1 溶剂效应和基质效应对吡咯烷酮响应值的影响(n=6)Fig.1 Effect of solvent and matrix effect on the peak of pyrrolidones (n=6)

2.2 基质效应考察

分别以联苯菊酯(25 g/L乳油)、啶虫脒(5%乳油)、高效氯氟氰菊酯(2.5%乳油)3种乳油型基质空白溶液，丁子香酚(0.3%可溶液剂)、桉油精(5%可溶液剂)、藜芦碱(0.5%可溶液剂)3种可溶液剂型基质空白溶液配制成20.0 mg/L混合标准溶液，在同一条件下对上述混合标准溶液进行6次重复测定，对比目标化合物在相同浓度下的响应值，考察基质效应对3种吡咯烷酮类农药助剂测定的影响，结果示于图1。由图1可知，采用空白基质溶液配制的混合标准溶液对吡咯烷酮有轻微的抑制作用，且同剂型和不同剂型样品间的结果差异较小。在实际样品测定中，采用溶剂直接配制标准曲线，在满足回收率要求的前提下，可进一步减少前处理步骤，使方法更加简便、快速，可操作性更强。

2.3 色谱、质谱条件的优化

农药助剂分析中常用的色谱柱有弱极性的HP-5MS柱[20-21]，中等极性的DB-624柱[22]和VF-1701ms柱[13,17]，强极性的VF-WAXms柱[12]，本实验逐一进行考察。结果表明，当使用弱极性的HP-5MS柱时，因吡咯烷酮极性较强，导致目标化合物出峰时间过早，化合物分离不完全；使用中等极性的DB-624柱时，2-吡咯烷酮和1-乙基-2-吡咯烷酮不能有效分离，且2-吡咯烷酮保留性质不佳，峰拖尾严重；VF-1701ms柱和VF-WAXms柱分离效果较好，3种目标化合物均能实现完全分离，且VF-WAXms柱在分流模式下峰形尖锐对称。因此本实验选择VF-WAXms柱作为分析柱。

对3种吡咯烷酮类农药助剂进行质谱全扫描，选择3～4个特征离子作为母离子，在10 eV碰撞能下进行产物离子扫描，选择碎片强度较大的二级碎片离子组成离子对，利用仪器的自动优化MRM功能确定定量和定性离子对以及最优碰撞能量，3种农药助剂的色谱、质谱参数列于表1，典型的MRM色谱图示于图2。

图2 3种吡咯烷酮类农药助剂典型的MRM色谱图Fig.2 Typical MRM chromatogram ofthree pyrrolidone pesticide adjuvants

2.4 线性关系和定量限

配制1.0～40.0 mg/L的系列混合标准溶液，按1.4节条件分析，以各农药助剂的定量离子对峰面积y与对应的质量浓度x(mg/L)绘制标准工作曲线，结果列于表2。由表2可知，3种农药助剂在1.0～40.0 mg/L范围内线性关系良好，相关系数(R2)均大于0.999。以信噪比约为10时，空白样品添加浓度计算方法的定量限为3.1～6.8 mg/kg，远低于《农药助剂禁限用名单》(征求意见稿)的限量要求(≤5%)，可满足乳油和可溶液剂型液体农药制剂中3种吡咯烷酮类农药助剂含量的测定和质量监管要求。

2.5 准确度和精密度

分别称取24份0.1 g啶虫脒(5%乳油)和丁子香酚(0.3%可溶液剂)样品(精确至0.000 1 g)于10 mL容量瓶中，添加1.0 mL NMP、NEP和PYR浓度分别为0.31、0.33、0.68 mg/L的对照品混合标准使用液(LOQ水平添加)，添加0.5 mL(0.05%水平添加)、1.0 mL(0.1%水平添加)、2.0 mL(0.2%水平添加)NMP、NEP和PYR浓度为100.0 mg/L的对照品混合标准使用液，每个水平重复测定6次，3种吡咯烷酮类农药助剂LOQ水平添加色谱图示于图3，准确度和精密度结果列于表3。由表3可知，3种农药助剂在啶虫脒(5%乳油)样品中加标回收率为98.2%～108.9%，相对标准偏差为0.4%～2.6%，在丁子香酚(0.3%可溶液剂)样品中加标回收率为98.1%～111.7%，相对标准偏差为0.4%～3.4%，能够满足乳油和可溶液剂型液体农药制剂中助剂常量分析水平的准确度和精密度要求。

2.6 与文献报道检测方法的比较

农药制剂样品基质较复杂，需进行前处理以减少基质干扰。已有文献[3，12-13]报道采用固相萃取小柱净化消除部分干扰物和不净化直接将样品稀释后分析的方法，在进行定量分析时，有采用溶剂直接配制标准曲线[3,12]和空白基质溶液配制标准曲线法[13]。将本研究与已报道的检测方法进行比较，选取氟啶脲(50 g/L乳油)和春雷霉素(2%可溶液剂)样品，分别按照文献报道方法和本方法进行测定，考察0.05%、0.1%、0.2%质量浓度添加回收率和相对标准偏差，结果列于表4。由表4可知，4种检测方法在3个质量浓度加标情况下的回收率为88.3%～110.2%，相对标准偏差为0.4%～7.7%，均能满足农药制剂中助剂常量分析水平的回收率要求。但本方法采用样品直接稀释进样，溶剂标准曲线定量分析，操作更简便，且灵敏度、准确度和精密度均优于文献报道方法。

表2 3种吡咯烷酮类农药助剂的线性范围、线性方程、相关系数和定量限Table 2 Linear ranges, regression equations, correlation coefficients and limits of quantification of the three pyrrolidone pesticide adjuvants

图3 3种吡咯烷酮类农药助剂在乳油型(a)和可溶液剂型(b)样品中LOQ水平添加色谱图Fig.3 Chromatograms of LOQ levels of three pyrrolidone pesticideadded in EC (a) and SL (b) samples

表3 3种吡咯烷酮类农药助剂在乳油型和可溶液剂型样品中回收率和精密度Table 3 Recoveries and RSDs for the three pyrrolidone pesticide adjuvants in EC and SL samples

表4 4种测试方法的样品测试结果、加标回收率及相对标准偏差Table 4 Sample results, recoveries and RSDs of four methods

2.7 实际样品检测

采用本方法检测市场上的94份乳油型和27份可溶液剂型农药制剂样品中的3种吡咯烷酮类农药助剂，结果列于表5。由表5可知，6份乳油型农药制剂检出N-甲基吡咯烷酮，含量为0.022%～11.328%，1份乳油型和1份可溶液剂型农药制剂检出2-吡咯烷酮，含量为0.018%～0.023%。其中，咪鲜胺(450 g/L乳油)样品N-甲基吡咯烷酮含量为11.328%，已超过《农药助剂禁限用名单》(征求意见稿)相关限量要求(≤5%)，存在一定风险，应引起相关管理部门重视。

表5 至少检出1种吡咯烷酮类农药助剂的农药制剂样品的检测结果Table 5 Results for pesticide formulations revealed at least one of the three pyrrolidone pesticide adjuvants

3 结论

本文建立了气相色谱-串联质谱法检测乳油和可溶液剂型液体农药制剂中3种高风险吡咯烷酮类农药助剂。与文献报道的检测方法相比，本方法的抗基质干扰能力更强、定性定量分析更准确、灵敏度更高。采用直接稀释进样，溶剂标准曲线定量，简化了操作步骤，增加了方法的灵敏性、准确性和适用性，能够满足乳油和可溶液剂型液体农药制剂中3种高风险吡咯烷酮类农药助剂同时测定的需要。