稳定同位素比技术用于橄榄油的掺假鉴定

马玉华，唐方东，刘佳煜，忻智炜，曾友石，杜 林，刘 卫

(1.中国科学院上海应用物理研究所，上海 201800；2.上海市计量测试技术研究院，上海 201203)

橄榄油富含不饱和脂肪酸(油酸占55%～83%)、角鲨烯、多酚以及维生素等营养物质，具有抗氧化、调节胆固醇、预防癌症、美容的功效和调整人体生理机能的作用，享有“植物油皇后”、“液体黄金”等众多美誉。近年来，橄榄油因其独特的风味和对人体的保健价值，受到广大消费者的青睐，在市场上的销售价格也较高，一般为大豆油的5倍左右。由于橄榄油产量远不能满足市场需求，市面上的橄榄油掺假、以次充好、产地冒用等违法行为屡禁不止。

传统鉴定方法一般都是针对橄榄油中特征组分和特征峰进行鉴别，存在一定的局限性，如检测时间长、不适用于痕量掺杂分析、不能对橄榄油进行产地溯源等[1-5]。有研究表明，应用色谱主成分分析鉴定法，当橄榄油与大豆油掺假比例达到6∶4时，才能测出油酸含量不满足国家标准[6]。因此，需要一种更有效、可量化的鉴定方法用于我国橄榄油进口和销售的市场监督。

稳定同位素比技术利用稳定同位素比质谱仪测定物质中碳、氢、氧、氮、硫等不同元素的同位素比值，具有灵敏度高、检测限低等优点，是掺假鉴定和产地溯源的主要研究方法之一，广泛应用于地质学、水文学、农业、医学和环境科学等领域[7-11]。国外同位素比技术在橄榄油品质鉴定的应用广泛[12-14]，同位素比的组成信息判别标准还被用于法律案件的参考[15]。目前，同位素比技术在我国橄榄油标准体系中的应用尚处于空白，国内相关研究处于起步阶段。已发表的文献[15-19]对植物油的碳稳定同位素比值进行了分析，而对植物油中氢稳定同位素的研究较少。吴玉銮等[20]测定了大豆油、花生油、玉米油、调和油的δ13C和δD；靳欣欣等[21]研究了对大豆油、玉米油掺杂芝麻油后，样品油中的氢、碳同位素。目前，尚未见利用氢稳定同位素技术进行橄榄油掺伪鉴别的报道。

同位素比技术在植物油品质鉴定应用中，C、H两种元素的研究最为广泛。植物中的碳同位素丰度比组成与植物光合作用途径有关，同时受植物生长环境气候条件的影响。一般可分为C3、C4、CAM植物，不同种类植物的δ13C值差异较大，油橄榄属于C3植物。因此，碳同位素比技术可以有效鉴定C4植物的植物油(如玉米油)对橄榄油的掺假，但无法有效鉴定同属于C3植物的植物油(如大豆油)对橄榄油的掺假，需要结合其他同位素丰度比的信息综合分析。植物体内的氢同位素丰度比组成受当地水文条件和气候条件的影响。因此，植物体内的氢同位素丰度比与地域密切相关，可以用于橄榄油的产地溯源。

为考察橄榄油中氢、碳稳定同位素比值与其他植物油的差异，以及为同位素比技术用于橄榄油鉴定提供数据基础，本工作拟以市场上销售的7种植物油为研究对象进行氢、碳稳定同位素比值检验，并对测量结果进行显著性差异分析。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Flash EA 2000型元素分析仪、MAT-253型稳定同位素比质谱仪、ConFlo IV型连续流接口装置、1～10 μL F3单道可变量程移液枪：美国Thermo Fisher Scientific公司产品。

标准样品IAEA-600(δ13CPDB=-27.771±0.043‰)、IAEA-CH-7(δDV-SMOW=-100.3±2.0‰)：美国NIST公司产品。

1.2 样品采集

市面上销售的7种植物油：包括7个品牌的橄榄油、4个品牌的花生油、5个品牌的玉米油、4个品牌的大豆油、3个品牌的葵花籽油、4个品牌的菜籽油和2个品牌的野山茶油。每种植物油取10 mL装入棕色玻璃瓶中，密封，置于4 ℃下冷藏。

1.3 实验条件

1.3.1氢稳定同位素比分析 元素分析仪条件的设定：载气(氦气)吹扫流量180 mL/min，高温裂解炉温度1 400 ℃，色谱柱温度85 ℃，参考气(氢气)流速100 mL/min，Disable Oxygen Injection点亮，不注入氧气；接口装置ConFlo IV条件设定：He稀释压力60 kPa。

1.3.2碳稳定同位素比分析 元素分析仪条件的设定：载气(氦气)吹扫流量180 mL/min，高温裂解炉温度1 000 ℃，色谱柱温度85 ℃，参考气(CO2)流速100 mL/min，氧气设为175 mL/min，注入2～4 s；接口装置ConFlo IV条件设定：He稀释压力60 kPa。

测试精度δ13C≤0.06‰，δD≤0.4‰。

1.4 氢碳同位素比值检测

1.4.1植物油样品δD、δ13C的测量 在1.3节条件下对橄榄油及其他6种植物油样本和标准品同时进行检测，每个样本重复测量5次，采用Isodat 3.0软件分析数据。

1.4.2同位素比值的表示及换算方法 同位素比值用δ(单位为‰)表示，δD、δ13C的相对标准分别为维也那标准平均海洋水(V-SMOW)和美国南卡罗莱纳州白垩系Pee Dee组拟箭石化石(PDB)。计算公式示于式(1)：

(1)

式中，R为重同位素与轻同位素的丰度比，即D/H和13C/12C。

1.5 数据校正与分析

用IAEA-600和IAEA-CH-7两种标准品对样本的δD、δ13C测量值进行校正得到真实值，校正公式示于式(2)：

(2)

用SPSS软件对橄榄油和其他6种植物油样本检测所得的δD、δ13C数据进行单因素方差分析(ANOVA)，用Pearson相关性检验对橄榄油的δD、δ13C进行相关性分析。

2 结果与讨论

2.1 橄榄油与其他6种植物油的δD特征

采用元素分析仪-稳定同位素比质谱仪(EA-IRMS)检测1 400 ℃下植物油中氢稳定同位素比值，示于图1，谱峰分别为参考气H2(Ref H2)、样品中氢元素转化的H2(Samp H2)。橄榄油与其他6种植物油的29份样本中δD的箱式图示于图2。7种植物油中，δD均值由高到低依次为：橄榄油>豆油>葵花籽油>玉米油>菜籽油>野山茶油>花生油，其中橄榄油样本中δD均值(-131.58±8.96)‰最高，花生油样本中δD均值(-225.97±1.58)‰最低，详细数据列于表1。其中，变异系数CV>5%的样本有橄榄油和菜籽油，分析发现2种样本中出现异常值。根据文献调研，欧洲原产橄榄油的δD范围为-165‰～125‰[22-23]，G品牌橄榄油不在此范围内，示于图3，可能存在产地冒用现象，或掺杂有精制橄榄油而非标称的特级初榨橄榄油。菜籽油中A品牌原料产地为西班牙，且生产工艺为萃取而非其他品牌的榨取。去除异常值后，橄榄油和菜籽油的δD均值分别为(-134.07±7.08)‰和(-197.76±7.35)‰，变异系数分别为5.28%和3.72%。

图1 植物油样本中氢稳定同位素比谱图Fig.1 Hydrogen stable isotope ratio chromatogram of vegetable oils

图2 不同品种植物油中δD值Fig.2 δD values of different kinds of vegetable oils

表1 橄榄油与其他6种植物油中δD值Table 1 δD values of olive oil and other six kinds of vegetable oils

图3 橄榄油样本中δD值与文献调研欧洲原产橄榄油δD值对比Fig.3 Comparison of δD values in olive oil samples with literature δD values of European olive oil

7种植物油样本中碳稳定同位素比值总体有显著差异(P<0.05)，橄榄油与花生油、玉米油、豆油、葵花籽油、菜籽油、野山茶油的δD均值分别相差91.90‰、56.49‰、41.53‰、50.71‰、63.69‰、90.72‰，存在显著差异(P<0.05，近似于0)。因此，δD测量适用于鉴定其他种类植物油掺假橄榄油。

2.2 橄榄油与其他6种植物油的δ13C特征

采用元素分析仪-稳定同位素比质谱仪检测1 000 ℃下植物油中碳稳定同位素比值，示于图4，谱峰分别为参考气CO2(Ref CO2)、样品中碳元素转化的CO2(Samp CO2)。橄榄油与其他6种植物油的29份样本中δ13C的箱式图示于图5。7种植物油中，δ13C均值由高到低依次为：玉米油>橄榄油>葵花籽油>野山茶油>菜籽油>花生油>豆油，其中玉米油呈现典型C4植物特征，δ13C均值(-15.92±0.51)‰最高，其余6种植物油(包括橄榄油)呈现典型C3植物特征，豆油样本中δ13C均值(-30.87±0.21)‰最低，详细数据列于表2，变异系数CV均低于2%。

图4 植物油样本中碳稳定同位素比谱图Fig.4 Carbon stable isotope ratio chromatogram of vegetable oils

7种植物油样本中碳稳定同位素比值总体上有显著差异(P<0.05)。橄榄油与花生油、玉米油、豆油、葵花籽油、菜籽油、野山茶油的δ13C均值分别相差0.97‰、13.16‰、1.79‰、0.35‰、0.73‰、0.50‰。其中，橄榄油与花生油、玉米油、豆油、菜籽油的碳稳定同位素比值具有显著差异(P<0.05)，与葵花籽油(P=0.20)和野山茶油(P=0.12)的差异不显著。因此，δ13C测量适用于鉴定C4植物的植物油掺假橄榄油的情况，但不适用于鉴定某些同为C3植物的植物油掺假橄榄油的情况，需要结合其他稳定同位素比值分析。

图5 不同品种植物油中δ13C值Fig.5 δ13C values of different kinds of vegetable oils

表2 橄榄油与其他6种植物油中δ13C值Table 2 δ13C values of olive oil and other six kinds of vegetable oils

2.3 橄榄油的δD和δ13C相关性分析

为研究橄榄油中δD和δ13C的相关性，对2.1节和2.2节中得到的δD和δ13C进行相关性分析，示于图6。结果表明，橄榄油样本中δD与δ13C相关(Pearson’sr=0.904)。该结果可以用于单一稳定同位素比分析的补充。

图6 橄榄油样本中δD和δ13C的相关性分析Fig.6 Correlation analysis of δD and δ13C of olive oil samples

2.4 橄榄油掺杂豆油、玉米油的模拟分析

在本次测量的6种植物油中，豆油和玉米油颜色清淡、无明显异味，常被用来掺假橄榄油。为分析氢、碳稳定同位素比对橄榄油中分别掺杂豆油和玉米油的鉴别效果，对掺杂比例为质量分数10%～90%的情况进行模拟。由于植物油的主要成分是甘油三酯[24]，因此可以假设橄榄油和豆油、玉米油中氢、碳总含量相同。用2.1节和2.2节分析得到的橄榄油、豆油和玉米油的δD和δ13C，换算成D/H和13C/12C后，对不同掺杂比例橄榄油的氢、碳同位素比进行计算模拟，示于式(3)，式(4)：

Rsample=(1+δ)Rstandard

(3)

其中，D/HV-SMOW取值为(155.76±0.05)×10-6，13C/12CPDB取值为(11 237.2±90)×10-6。

(4)

式中，R为样品中氢稳定同位素比D/H或碳稳定同位素比13C/12C；M为橄榄油的质量；m为掺入油(豆油或玉米油)的质量。

模拟结果示于图7，图中阴影部分为橄榄油本身稳定同位素比的范围，点线图为计算得到的掺假油稳定同位素比。

从图7a可以看出，氢稳定同位素比分析在豆油、玉米油分别掺杂橄榄油鉴定方面均适用，豆油掺杂比例为质量分数30%以上、玉米油掺杂比例为质量分数约25%以上时，掺假油的D/H比值超出橄榄油本身氢稳定同位素比范围。从图7b可以看出，碳稳定同位素比分析适用于玉米油掺杂橄榄油鉴定，掺杂比例为质量分数10%以上时，掺假油的13C/12C比值超出橄榄油本身碳同位素比范围，不适用豆油掺杂鉴定，掺杂橄榄油后掺假油的13C/12C比值与橄榄油本身碳同位素无明显差别。氢、碳稳定同位素比相结合能检测出玉米油掺假10%、豆油掺假30%以上的情况。

注：a.氢稳定同位素比；b.碳稳定同位素比图7 掺假橄榄油的稳定同位素比模拟分析Fig.7 Simulation analysis of adulterated olive oils

3 结论

本工作研究了市场上销售的橄榄油与其他6种植物油中氢、碳稳定同位素比值特征，对数据进行统计分析。结果表明：橄榄油中δD范围为-146.78‰～-125.30‰，δ13C范围为-29.72‰～-28.59‰，与其他品类植物油中氢稳定同位素比值差异显著(P<0.05)，与除葵花籽油、野山茶油外的植物油中碳稳定同位素比值差异显著(P<0.05)，且橄榄油中氢、碳稳定同位素比值具有较强相关性(Pearson’sr=0.904)。同时，以理论计算模拟大豆油和玉米油对橄榄油进行掺假，计算结果表明，氢、碳稳定同位素比结合分析能检测出玉米油掺假10%、豆油掺假30%以上的情况。同位素比技术能够对橄榄油掺假进行鉴定，且理论检测限较低，实际检测限有待进一步验证。