电子自旋共振波谱法检测60Co-γ射线辐照中药材

梁 倩， 李咏富， 何扬波， 龙明秀， 田竹希， 石 彬

(贵州省农业科学院现代农业发展研究所，贵州 贵阳 550006)

由于中药材植物生长的特性，常含有大量的有机质，容易受到微生物的污染[1]，需要进行灭菌处理，常用方法有化学熏蒸灭菌、干热湿热灭菌、水洗除菌及辐照灭菌[2]，但均存在一定的局限性，对中药材中易挥发、热不稳定成分影响较大，而且会对环境造成一定的污染[3-4]。2015 年版《中国药典》规定，辐照灭菌技术为原料药灭菌方法之一，它是指将物品置于适宜放射源辐射的γ射线或适宜的电子加速器发生的电子束中进行电离辐射而达到杀灭微生物的方法，具有穿透力强、无化学残留、处理成本低、能耗少等优点[5-6]，适用于含有热敏性成分、含糖成分高、易霉变的中药材的灭菌[7-8]。

目前，中药材辐照灭菌存在以下问题：企业在生产加工中药材过程中卫生要求达不到标准，导致中药材细菌数量严重超标，或者省去中药材原材料的灭菌过程，对其进行加工成制剂后利用高剂量辐照对其进行处理，导致辐照剂量超过国家标准；中药材辐照灭菌的效果不一，部分微生物例(如革兰氏阳性微生物)很难杀死，大多数药厂会因其不达标而进行重复辐照。中药材辐照灭菌技术得到推广应用的同时，其安全性问题也成为了关注点之一[9-10]。

常用于鉴定辐照物品和食品的检测方法有光释光法、热释光法、电子自旋共振(electron spin resonance，ESR)波谱法等[11-12]，但目前对ESR波谱法的应用相对较少，它可以灵敏地检测出自由基的产生[13-14]，其原理是样品通过辐照产生的自由基被样品中的骨头、纤维素等固体或干硬物捕获，从而被检测出来，具有灵敏、便捷、对样品无损伤等优点，已成功应用在干果[15-16]、植物[17-18]、肉类[19-20]、医疗器械[21]检测中，但鲜有涉及中药材。本实验对辐照杜仲、金银花、黑骨藤ESR信号强度与吸收剂量之间关系等进行研究，为中药材辐照质量控制提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器 微型电子自旋共振(ESR)波谱仪，德国Bruker公司；CX-100型高速多功能粉碎机，上海缘沃工贸有限公司；40目标准检验筛，浙江上虞市华丰五金仪器有限公司；60Co-γ辐射源，贵州省金农辐照技术有限公司。

1.2 药材 杜仲、金银花、黑骨藤购于贵州省贵阳市中药材市场，经专家鉴定为正品，自然晾干后用粉碎机将其粉碎，过40目筛，聚乙烯自封袋包装，备用。

1.3 方法

1.3.160Co-γ射线辐照 称取3种药材各10 g，装入7组聚乙烯自封包装袋中，每种6组，设置吸收剂量为1、3、5、7、9、12 kGy，对其进行60Co-γ射线辐照，室温保存。采用重铬酸银剂量计标定，剂量计与中国计量科学院剂量计(NDAS)对比，要求误差小于±3%。

1.3.2 ESR检测 准确称取辐照后样品适量，装入ESR管中，压实，置于谐振腔中，每个样品平行3份，重复测量3次。工作条件为中心磁场3 460 Gs；扫描宽度100 Gs；微波功率15～40 mW；调制振幅5.3 Gs；温度室温。

2 结果

2.1 ESR对杜仲60Co-γ射线辐照后的影响

2.1.1 信号强度与微波功率的关系 图1显示，吸收剂量7 kGy、微波功率0.5～15 mW时波谱峰信号强度为1.2～13.47，信号强度越大，波谱峰振幅越明显，故选择15 mW。

图1 微波功率对杜仲60Co-γ射线辐照后信号强度的影响

2.1.2 波谱信号 辐照处理后，植物中重点纤维素和多糖在60Co-γ射线作用下能诱导产生自由基，含有未成对电子，在外加磁场的作用下会产生自旋共振吸收现象[22]。不同剂量辐照后杜仲粉ESR波谱图(0～12 kGy)见图2，可知在0 kGy时在中心磁场出现1个特征峰，其中波谱特征参数g=2.006 8±0.001 9，正负峰高之间磁场宽度ΔH=49.32 Gs；经过0～12 kGy剂量辐照后，在中心磁场区域出现的波谱峰信号强度均增大，在12 kGy时更明显。

2.1.3 信号强度与吸收剂量的关系 杜仲吸收剂量与ESR波谱信号强度呈正相关，二次拟合式为Y=-0.006 5X2+1.207 1X+6.778 7(r=0.984 3)，在0～12 kGy范围内线性关系良好。

图2 不同剂量60Co-γ射线辐照后杜仲ESR波谱图

2.1.4 信号强度与贮藏时间的关系 贮藏时间是影响ESR强度变化的重要因素[23]，本实验在相同贮藏条件下，检测0～80 d内各药材60Co-γ射线辐照后ESR信号强度，结果见表1。由此可知，在20 d时吸收剂量1 kGy的ESR信号强度衰变了44%，3～9 kGy衰变了60%左右，12 kGy衰变了80%；在20～80 d时，衰变趋势变平缓；在80 d时，所有吸收剂量的ESR信号强度衰变平均超过70%，其中12 kGy衰变了90%，表明杜仲最佳检测时间在80 d内。

表1 60Co-γ射线辐照后杜仲在不同贮藏时间的ESR信号强度

2.2 ESR对金银花60Co-γ射线辐照后的影响

2.2.1 信号强度与微波功率的关系 图3显示，吸收剂量7 kGy、微波功率25 mW时波谱峰振幅较明显，故选择25 mW。

图3 金银花60Co-γ射线辐照后微波功率对信号强度的影响

2.2.2 波谱信号 金银花经1、3、5、7、9、12 kGy60Co-γ射线辐照后，ESR波谱信号强度见图4。由此可知，辐照前在中心磁场出现1个特征峰，其中波谱特征参数g=2.006 5±0.001 0，正负峰高之间磁场宽度ΔH=41.3 Gs；辐照后中心磁场的波谱峰信号强度均发生改变，ESR波谱峰信号强度均有所增大；随着吸收剂量增加，波谱峰信号强度、自由基总量升高，在特征峰两边出现较不明显的对称峰，这是由于纤维素辐照后产生的自由基特征峰[24]。

图4 不同剂量60Co-γ射线辐照后的金银花ESR波谱图

2.2.3 信号强度与吸收剂量的关系 金银花吸收剂量与ESR波谱信号强度呈正相关，二次项拟合式为Y=-0.032 4X2+1.707 8X+2.788 9(r=0.998 8)，在0～12 kGy范围内线性关系良好。

2.2.4 信号强度与贮藏时间的关系 在0～80 d内60Co-γ射线辐照后金银花ESR信号强度随时间的变化规律见表2。由此可知，在20 d时，吸收剂量1～9 kGy的ESR信号强度衰变在50%～70%之间，12 kGy衰变了80%；在2～80 d时，衰变趋势变平缓；在80 d时，所有吸收剂量的ESR信号强度衰变均超过60%，并且与未辐照时的信号强度峰值接近，表明金银花最佳检测时间在80 d内。

表2 60Co-γ射线辐照后金银花在不同贮藏时间的ESR信号强度

2.3 ESR对黑骨藤60Co-γ射线辐照后的影响

2.3.1 信号强度与微波功率的关系 图5显示，吸收剂量7 kGy、微波功率0.5～70 mW时，波谱信号强度先明显升高在40 mW后趋于平稳，而且微波功率过高会引起波谱峰的不稳定，故选择40 mW。

图5 黑骨藤60Co-γ射线辐照后微波功率对信号强度的影响

2.3.2 波谱信号分析 黑骨藤经1、3、5、7、9、12 kGy60Co-γ射线辐照后，ESR波谱信号强度见图6。由此可知，辐照前ESR波谱峰出现在磁场中心范围，g=2.006 4±0.001 0，磁场宽度ΔH=51.68 Gs；辐照后谱峰信号强度升高；黑骨藤以根茎入药，该部位有大量纤维，而在特征峰两旁也产生了具有纤维素特征的对称峰。

图6 不同剂量60Co-γ射线辐照后的黑骨藤ESR波谱图

2.3.3 信号强度与吸收剂量关系 黑骨藤吸收剂量与ESR波谱信号强度呈正相关，二次项拟合式为Y=-0.201 2X2+4.083 3X+9.426 9(r=0.940 4)，在0～12 kGy范围内线性关系良好。

2.3.4 信号强度与贮藏时间关系 在0～80 d内60Co-γ射线辐照后黑骨藤ESR信号强度随时间的变化规律见表3。由此可知，在20 d时，所有吸收剂量的ESR信号强度在吸收剂量1、3 kGy下衰变为40%，其余均衰变超过60%；在20～80 d时，衰变趋势变平缓；在80 d时，ESR信号强度衰变值均未达到辐照前水平。再考察ESR信号强度与贮藏时间的关系，结果见表4，发现最短检测时间为97 d，表明黑骨藤最佳检测时间在97 d内。

表3 60Co-γ射线辐照后黑骨藤在不同贮藏时间的ESR信号强度

3 讨论

杜仲、金银花、黑骨藤在射线的作用下能诱导自由基的产生，自由基中有未成对电子，在外加磁场作用下会产生自旋共振吸收现象，ESR检测后信号强度反映了共振条件下样品吸收的总能量，自由基含量越大，信号强度越大[25]。辐照后，3种中药材ESR波谱峰振幅强度均发生改变，并且与未辐照的波谱峰振幅强度相比均有所增大，说明辐照产生的自由基含量随着吸收剂量增加而增加，与辐照树豆荚[26]一致。吸收剂量与波谱信号之间呈正相关，在辐照范围内相关性均良好(r≥0.95)，与辐照中药颗粒[27]一致，说明用ESR可以检测辐照中药材。李伟明[28]等发现，在15 d内葡萄皮ESR信号强度衰减为80%，葡萄籽和葡萄柄衰减为50%。贮藏时间直接影响了辐照后信号强度的衰变[29]，在80 d内杜仲与金银花药材的辐照信号强度衰变值与未辐照的信号强度值接近，因此≤80 d内对辐照杜仲、金银花的检测较为准确；通过线性拟合得出，黑骨藤最佳检测时间为≤97 d。另外，微波功率对波谱信号强度有一定的影响，这与前期报道一致[30]。

表4 黑骨藤信号强度与贮藏时间的拟合结果

4 结论

本实验探索杜仲、金银花、黑骨藤辐照后ESR信号强度与微波功率、吸收剂量、贮藏时间之间的关系，证明诱导产生的自由基与波谱峰信号强度之间呈正相关，微波功率对波谱信号有一定的影响；吸收剂量与波谱信号之间呈正相关，在辐照范围内相关性良好(r≥0.95)；贮藏时间对波谱信号有一定的影响。因此，建议在80 d内对辐照杜仲、金银花，97 d内对辐照黑骨藤进行鉴定。