八聚精氨酸的Fmoc固相合成及其提高载体穿透细胞膜能力的研究

易明珠，王丹丰，王 胜，潘洁怡，余 庆，安光辉，孙少平，*，梁 娜，*

(1. 哈尔滨师范大学 化学化工学院，哈尔滨 150025；2.黑龙江大学 化学化工与材料学院，哈尔滨 150080)

0 引 言

固相法合成多肽已成为合成30肽以下小肽的主要方法[1],在合成过程中所运用的氨基酸保护策略主要有Fmoc法[2]和Boc[3-4]法。Boc法氨基保护策略缺点为合成过程中条件苛刻，需要使用强酸HF脱除氨基酸的保护基团，并且不能随时监测，因此很难用于小肽的大规模自动合成。相对于Boc法，Fmoc法反应条件温和，在接肽过程中可以避免反复使用强酸，并且每次脱保护过程中能够释放出可检测的化合物，可实现随时监测。

细胞穿膜肽是人类在研究艾滋病的过程中发现的一种寡肽，一般由阳离子氨基酸组成。最具有代表性的穿膜肽为HIV-1 TAT蛋白、寡聚精氨酸，而八聚精氨酸(octaarginine, R8)是在TAT 49-57寡肽的研究基础上所筛选的具有较强穿膜能力的膜活性肽，能够高效地穿过与之相接触的细胞膜[5-6]。近年来，大量研究表明，经八聚精氨酸修饰的载体可以提升药物入胞效率[7-9]。

本文采用Fmoc方法固相合成八聚精氨酸，以期对八聚精氨酸合成工业化以及提高药用载体的穿膜性提供必要的基础。

1 实验部分

1.1 材料与试剂

多肽合成反应器(50 mL, 自制)；多肽活化器(50 mL, 自制)；Fmoc-pbf-精氨酸(上海吉尔生化)；N,N-二异丙基乙胺(DIEA，萨恩化学技术(上海)有限公司)；王树脂(晶纯生化科技股份(上海)有限公司)；2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU，上海麦克林生化科技有限公司)；N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷(DCM)、哌啶、三氟乙酸(TFA)均为国产分析纯。

1.2 八聚精氨酸的合成

1) 第一个氨基酸与树脂的酯化反应：取定量的王树脂置于多肽合成反应器中，加入DMF浸泡2 h，抽干；在活化器中，加入一定量的Fmoc-pbf-精氨酸、HATU、DIEA，使其与王树脂的摩尔比为3∶2.85∶6∶1，于DMF中活化2 h；将活化器中的溶液加入含有树脂的多肽反应器中，磁力搅拌下继续反应3 h。将所得产物高速离心，DMF、DCM交替洗涤5次，抽干。

2) 脱除Fmoc保护基：向抽干后的1)产物中加含有20%哌啶的DMF溶液，反应1 h，脱除Fmoc基团。

3) 肽键的形成：向脱除Fmoc保护基的树脂2)中加入活化的Fmoc-pbf-精氨酸继续反应。理论上每重复步骤2)～3)，都会反应上一个精氨酸，直至树脂上接上8个精氨酸。

4) 树脂与八聚精氨酸的分离：将所得到的白色产物置于反应瓶中，加入TFA，室温下搅拌3 h，减压抽滤，弃去固体，用乙酸乙酯将产品转移至圆底烧瓶中，旋转蒸发除去乙酸乙酯，冻干，即得白色产物，称重，计算产率。

1.3 分析与检测

采用茚三酮定性显色法监测反应过程，并且用质谱分析鉴定产品。理论取代度与酯化效率的计算方法如下：

采用溴化钾(KBr)压片法，于4 000～400 cm-1对产物进行红外光谱测定。

1.4 细胞膜穿透能力的考察

为考察八聚精氨酸的修饰对于体系进入细胞能力的影响，借助于FITC荧光标记技术，以FITC为对照，于倒置荧光显微镜下观察偶联八聚精氨酸的FITC的细胞摄取行为。具体操作如下：精密称定FITC，配制成浓度为1 mg·mL-1的FITC-DMSO溶液。取八聚精氨酸溶液，加入适量的FITC溶液，室温下避光搅拌8 h。将反应液置于透析袋中(MWCO：3 500 Da)，蒸馏水透析24 h，得到FITC标记的八聚精氨酸溶液。

将FITC溶液与偶联八聚精氨酸的FITC溶液分别加入到培养板中，于细胞培养箱中孵育0.5 h，吸去培养液，用PBS溶液冲洗细胞3次，于荧光倒置显微镜下观察细胞的摄取情况。

2 结果与讨论

2.1 王树脂取代度对酯化效率的影响

将不同取代度的王树脂与Fmoc-pbf-精氨酸在相同条件下反应，测定其酯化效率，结果见表1。由表1可见，在与王树脂缩合的反应过程中，氨基酸与王树脂的酯化效率随王树脂取代度的减小而增大。随着取代度的减小，王树脂在DMF中的溶胀度随之变大，导致树脂内部网格空间变大，反应活性点密度变小。因此，已酯化的氨基酸对树脂内邻近的其它反应活性点的位阻变小，使得氨基酸的进一步缩合位阻变小，从而使缩合效率增大。而酯化效率的增大使得产率增大。

表1 王树脂取代度对酯化效率的影响

采用Fmoc策略合成的第一步是将一个Fmoc保护的精氨酸的羧基通过酯键连接到载体树脂上，此步的连接效率不仅影响到后续反应氨基酸的用量，也影响八聚精氨酸的收率。因此，第一步连接效率在固相多肽合成的研究中至关重要。考虑到反应效率以及成本等因素，本研究采用取代度1.0 mmol·g-1的王树脂作为载体。

2.2 搅拌方式对酯化效率的影响

取同一批王树脂(取代度1.0 mmol·g-1)分别与Fmoc-pbf-精氨酸反应，在其他反应条件相同的情况下，考察机械搅拌(200 rpm)与恒温振荡器搅拌(200 rpm)两种搅拌方式对酯化效率的影响。

由结果可见，酯化反应效率在机械搅拌的条件下为71.2%，高于恒温振荡器中的61.9%。在固相反应的固-液两相反应体系中，Fmoc-pbf-精氨酸必须与王树脂内部的羟基充分接触才能发生反应。增加搅拌强度可以提高膜扩散速率，机械搅拌强度远大于恒温振荡器搅拌强度，因此机械搅拌的反应效率要更高一些。

2.3 王树脂粒度对酯化效率的影响

将2批粒度不同、取代度相同的王树脂(1.0 mmol·g-1)，分别与Fmoc-pbf-精氨酸在相同的条件下反应，结果见表2。由表2可见，王树脂粒径越小,酯化效率越高。这是由于粒径越小,粒子比表面积越大，树脂表面裸露的羟基相对更多；另外，王树脂的粒径越小，反应物扩散的路径越短，越有利于酯化反应中Fmoc-pbf-精氨酸及缩合试剂的粒内扩散和缩合反应的进行。

2.4 八聚精氨酸粗品的鉴定

将冷冻干燥后的样品溶解在甲醇中，取3 μL的溶液置于基板中，待其干燥后，用飞行质谱进行检测。结果见图1。由八聚精氨酸的结构推断所合成的产物理论分子量为1 267.6。对照质谱结果，推断m/z =1 283.98的峰为[M+OH]-的分子离子峰，所得到的终产物分子量为1 266.98，与八聚精氨酸的理论分子量基本一致，由此可以证明产物中含有八聚精氨酸。

表2 王树脂粒度对酯化效率的影响

对产物进行进一步的红外分析，结果见图2。由图2可见，在产物的红外图谱中，位于3 373 cm-1处的强峰由游离氨基的伸缩振动所产生；1 452 cm-1处的吸收峰由精氨酸中胍基的不对称伸缩振动引起；位于1 665 cm-1以及1 544 cm-1处的吸收峰分别归属于羰基的C-O伸缩振动(酰胺I带)以及仲胺基的N-H弯曲振动(酰胺II带)；于1 213 cm-1处观察到的信号峰为酰胺键中C-N的吸收峰。这些现象充分证明了酰胺键的存在，表明已成功制备了八聚精氨酸。

图1 八聚精氨酸的质谱图Fig.1 Mass spectrum of crude octaarginine

图2 八聚精氨酸的红外图谱Fig.2 FT-IR spectrum of crude octaarginine

2.5 八聚精氨酸修饰对于细胞膜穿透能力的影响

将FITC溶液与偶联八聚精氨酸的FITC溶液分别与MCF-7细胞共孵育0.5 h，于荧光倒置显微镜下观察细胞的摄取情况，结果见图3。

图3 FITC(a)与八聚精氨酸修饰的FITC(b)在MCF-7细胞中的摄取行为Fig.3 Fluorescent images of MCF-7 cells incubated with FITC (a) and octaarginine modified FITC (b)

由图3可见，与单纯的FITC相比，经八聚精氨酸修饰后的FITC，其进入细胞的能力显著增强，细胞内的荧光强度明显增大，在细胞内可观察到聚集的高亮荧光块，表明八聚精氨酸的修饰能够显著增强FITC穿透细胞膜的能力。

3 结 论

本文采用Fmoc固相合成法制备八聚精氨酸，并考察八聚精氨酸的修饰对于体系细胞摄取能力的影响。研究结果表明，固相反应效率受多种因素的影响，对于同一种保护氨基酸而言，王树脂的取代度越低，树脂粒度越小，缩合反应效率越高；适当增强搅拌强度以提高缩合反应效率。研究所制备的八聚精氨酸能够显著增强体系穿透细胞膜的能力，其有望用于修饰药用载体，为增强药物穿透细胞膜的能力、提高药效提供必要的基础。