鸡尾酒双染CD31/D2-40和CKpan在脉管癌栓病理诊断中的应用价值

王玥元，赵 洁，田 芳，周庆云，石清芳

脉管癌栓与肿瘤患者的术后辅助治疗及预后关系密切。近年多采用免疫组化CD31/D2-40标记血管、淋巴管内皮细胞，然而仅使用单项的免疫组化标记，仍无法确定脉管内细胞团是否有癌细胞，免疫组化鸡尾酒双染法是一种可以在组织中同时标记两类不同抗原的方法，可同时双染脉管内皮细胞和其内癌细胞[1-2]。本实验联合检测CD31/D2-40和上皮细胞标志物(CKpan)，分别行HE染色、免疫组化单染CD31/D2-40、鸡尾酒双染CD31/D2-40/CKpan，分析鸡尾酒双染法在脉管癌栓病理诊断中的价值。

1 材料与方法

1.1 材料收集2013年6月～2019年9月甘肃省妇幼保健院接受手术且经病理筛查有可疑脉管癌栓(排除淋巴结有转移者)的子宫颈癌48例、子宫内膜腺癌30例、乳腺癌40例，标本均经10%中性福尔马林固定，常规石蜡包埋，4 μm厚连续切片，挑选有疑似脉管癌栓的切片，同时行HE染色、免疫组化单染CD31/D2-40、鸡尾酒双染CD31/D2-40/CKpan。

1.2 试剂及仪器CD31、D2-40、CKpan(AE1/AE3)鼠抗人单克隆抗体均购自福州迈新公司，鸡尾酒双染试剂盒购自美国罗氏公司。使用Ventana Benchmark XT免疫组化染色平台。

1.3 染色方法

1.3.1免疫组化单染 65 ℃烤片1.5 h，烤片后贴标签上机开始脱蜡(EZ)，碱性修复液(CC1)99 ℃ 30 min修复后，滴加一抗CD31/D2-40，CD31于37 ℃孵育32 min，D2-40于37 ℃孵育40 min，加二抗试剂(ultraView universal DAB kit)进行反应，呈棕色(二抗HRP multimer和DAB+H2O2的孵育时间均为8 min)，加入苏木精和Bluing返蓝液衬染，程序结束取出切片，梯度乙醇脱水至二甲苯，中性树胶封固。

1.3.2鸡尾酒双染 玻片完成烤片贴标签上机后开始脱蜡(EZ)，碱性修复液(CC1)99 ℃ 30 min修复，滴加一抗CD31/D2-40，CD31于37 ℃孵育32 min，D2-40于37 ℃孵育40 min，加入二抗试剂(ultraView universal DAB kit)进行反应，呈棕色(二抗HRP multimer和DAB+H2O2的孵育时间均为8 min)，反应结束升温至95 ℃变性4 min。一抗CKpan，37 ℃孵育16 min/20 min，孵育结束加入抗试剂(ultraView universal AP RED kit)进行反应，呈红色(二抗Red multimer反应12 min，Fast A+Naphtol和Fast B分别反应8 min)，加入苏木精和Bluing返蓝液衬染，程序结束取出切片，梯度乙醇脱水至二甲苯，中性树胶封固，在显微镜下观察染色。

1.4 结果判定D2-40定位于淋巴管内皮细胞的胞质中，CD31定位于血管内皮细胞膜，棕黄色为阳性；CKpan定位于上皮细胞质，红色为阳性。

1.5 统计学分析所有数据采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，计数资料采用χ2检验分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组化单染CD31/D2-40的表达临床病理诊断中常有无法直接确认是否为脉管癌栓的情况，如组织处理过程中肿瘤细胞巢周围形成的空隙(图1)。本组切片经免疫组化单染CD31/D2-40，结果显示：癌组织中血管与淋巴管内皮细胞着色，分别被染成棕色均匀平滑连续的细管状，但仍然不能确定脉管内细胞团是癌细胞、淋巴细胞、红细胞或组织细胞(图2、3)。

2.2 鸡尾酒双染CD31、D2-40、CKpan的表达本组鸡尾酒双染切片中淋巴管、血管染成连续平滑着色的棕色细管状，管内癌细胞的胞膜、胞质均匀着红色，呈棕色细管包绕红色细胞团(图4、5)。

2.3 三种染色方法癌栓诊断阳性率比较所有切片染色后分别由两位病理主任医师采用双盲法阅片。本组结果显示：三种染色方法在子宫颈癌为87.50%、89.60%、83.30%；在子宫内膜癌为86.70%、80.00%、76.70%；在乳腺癌脉管癌栓为82.50%、87.50%、65.00%；总阳性率为85.60%、86.40%、75.40%。其中鸡尾酒双染法癌栓检出率及总癌栓检出率均低于其它两种方法(表1)。HE染色与免疫组化单染在脉管癌栓检出率为88.98%、86.44%，两者差异无统计学意义(P=0.552，表2)。鸡尾酒双染法癌栓检出率(75.42%)与HE染色(88.98%)、免疫组化单染(86.44%)相比，结果较低，差异有统计学意义(P=0.006，P=0.031，表3)。

表1 三种染色方法诊断脉管癌栓的阳性率

表2 HE染色与免疫组化单染脉管癌栓检出率比较

表3 鸡尾酒双染与HE染色、免疫组化单染脉管癌栓检出率比较

3 讨论

癌细胞侵入肿瘤附近组织的血管和淋巴管形成静脉癌栓和淋巴管癌栓，常规病理切片难以鉴别，临床将淋巴管癌栓和静脉癌栓统称为脉管癌栓，脉管癌栓在肿瘤的预后分析中一直被视为重要危险因素，研究表明在子宫颈癌、子宫内膜癌、乳腺癌、胃癌、结直肠癌等肿瘤中，脉管癌栓是复发(局部复发和远处复发)和生存的独立预后因素[3-7]。因此，准确有效的诊断脉管癌栓是病理诊断的重要组成部分。传统HE染色对组织处理过程中癌细胞周围产生的间隙与真正的癌栓无法准确鉴别，存在过诊断或漏诊可能，多数情况下不能区分静脉癌栓和淋巴管癌栓，目前这两种癌栓的临床意义尚不明确。本组使用CD31/D2-40行免疫组化单染和CD31/D2-40/CKpan鸡尾酒双染与HE染色对比，发现免疫组化单染虽然可以区分血管和淋巴管，但对于脉管内的细胞究竟是否为癌细胞没有帮助，癌栓总检出率比HE染色略高，差异无统计学意义，而鸡尾酒双染的癌栓检出率最低，分别与HE染色、单染比较，差异有统计学意义。本组分析得出结论：(1)HE染色、免疫组化单染时有一部分不是癌栓的细胞团被误诊为癌栓，导致诊断癌栓阳性率偏高，即过诊断，增加了肿瘤患者术后辅助治疗产生的经济负担和心理负担。(2)与其它两种方法相比，鸡尾酒双染实验结果直观，可高效发现癌栓，提高病理诊断的准确性，值得在临床病理工作中推广应用。本实验只关注于上皮组织来源肿瘤的癌栓，如肉瘤则不适用于鸡尾酒双染CD31/D2-40/CKpan。另外，即使在鸡尾酒双染切片中诊断癌栓同样需结合癌细胞的形态学特征及其他免疫组化表达，进行综合判断。