联合检测7种自身抗体在非小细胞肺癌中的诊断价值

陈 志，王玉红，朱卫东，孙晓静，郭凌川

肺癌是我国常见的恶性肿瘤之一，提高肺癌患者的生存率，早期筛查和诊断至关重要。有文献报道血液中肿瘤相关抗原(tumor associated antigen, TAA)自身抗体检测对早期肺癌有良好的诊断效能[1]。国内外有研究证实多种TAA与肺癌相关，且肿瘤患者血清TAA水平与健康人群存在明显差异，可用于肺癌患者的早期筛查和临床诊断[2-4]。本文采用7种TAA自身抗体(p53、PGP9.5、SOX2、GAGE7、GBU4-5、MAGEA1、CAGE)，检测血液中7种自身抗体的含量，探讨其对非小细胞肺癌诊断的价值和意义，旨在提高临床与病理医师的认识水平。

1 材料与方法

1.1 材料收集2019年8～12月苏州大学附属第一医院病理科行肺癌自身抗体检测，并有活检或手术病理诊断为非小细胞肺癌的标本443例。其中男性170例，女性273例；腺癌410例，鳞癌18例，其他类型15例。另随机选择同期体检健康的人群405例作为对照组。

1.2 主要仪器与试剂Multiskan MK3型酶标仪(Thermo公司)，ELISA检测试剂盒(上海优选生物公司)，离心机，加样器，恒温箱等。

1.3 方法采集所有患者静脉血5 mL(促凝管)，登记编号，离心机3 000 r/min离心10 min，取上清。设置标准品孔和样本孔，用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度(OD值)。采用ELISA法检测7种自身抗体浓度，以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。

1.4 统计学分析采用SPSS 20.0软件进行统计学分析。因血清抗体水平呈偏态分布，故用中位数M(p25，p75)法表示，两组间比较采用非参数Mann-WhitneyU检验。通过绘制ROC曲线分析抗体单项及联合检测的诊断效能。抗体阳性率对比及临床病理特征分析采用χ2检验，比较组间差异。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 7种自身抗体的检测水平非小细胞肺癌组与对照组均采用中位数法M(p25，p75)表示每个抗体的分布情况。两组间相比，除PGP9.5抗体(P=0.154)无差异外，非小细胞肺癌组p53(P<0.001)、SOX2(P=0.049)、GAGE7(P=0.040)、GBU4-5(P=0.005)、MAGEA1(P=0.025)、CAGE(P=0.036)血清含量均高于对照组，差异有统计学意义(表1，图1)。

2.2 7种自身抗体的阳性率非小细胞肺癌组7种自身抗体的检测阳性率为0.9%～22.35%，对照组阳性率为0～4.20%。每种抗体的cut off值参照检测试剂盒的诊断标准：p53<13.1 U/mL、PGP9.5<11.1 U/mL、SOX2<10.3 U/mL、GAGE7<14.4 U/mL、GBU4-5<7.0 U/mL、MAGEA1<11.9 U/mL、CAGE<7.2 U/mL，大于或等于参考值即为阳性。本组结果显示非小细胞肺癌组p53阳性率最高(22.35%)，PGP9.5阳性率最低(0.90%)，其余阳性率为2.48%～13.54%。与对照组相比，非小细胞肺癌组p53、SOX2、GAGE7、GBU4-5、MAGEA1、CAGE均有较高的阳性率(P<0.001)，PGP9.5无差异(P>0.05)。将7种自身抗体联合检测(任一种抗体阳性即视为阳性)分析，非小细胞肺癌组的阳性率为56.66%，对照组的阳性率为6.42%，两者相比差异有显著性(P<0.001，图2)。

2.3 7种自身抗体的诊断效能评价本组以患者的病理诊断结果为判断金标准，将病理诊断为非小细胞肺癌的患者作为疾病发生组，将健康人群作为对照组，绘制每个抗体的ROC曲线及联合检测的ROC曲线，分析7种自身抗体的诊断效能。进一步分析各个抗体及联合检测的曲线下面积(AUC)，每种抗体作为单一因素时，PGP9.5无诊断效能(P>0.05)，其他指标虽有统计学意义，但敏感性、特异性参差不齐，诊断效能不高。联合检测敏感性达56.66%、特异性为93.58%，AUC为0.751，具有较高的诊断效能(P<0.001，表2，图3)。

2.4 联合检测7种自身抗体与非小细胞肺癌临床病理特征的关系本组分析非小细胞肺癌组7种自身抗体联合检测与肺癌临床病理特征的关系，结果显示：患者性别(P>0.05)、年龄(P>0.05)、肿瘤大小(P>0.05)、病理分型(P>0.05)、淋巴结转移(P>0.05)、TNM分期(P>0.05)以及ALK(P>0.05)与7种自身抗体联合检测无关；而PD-L1(P<0.05)表达与7种自身抗体联合检测有关(表3)。

图1 7种自身抗体的检测浓度分布：A.p53；B.PGP9.5；C.SOX2；D.GAGE7；E.GBU4-5；F.MAGEA1；G.CAGE

表3 联合检测7种自身抗体与非小细胞肺癌临床病理特征的关系

图2 7种自身抗体的阳性率

3 讨论

肺癌的发生、发展是在多种致癌因素和多基因影响下经过多个步骤形成的。目前，临床广泛采用的诊断手段多为X线、CT、MRI等影像检查或纤维支气管镜及肺穿刺等病理诊断方法。近年血清生物学标志物的检测越来越受到关注，其价格低廉、样本获取容易，且检测结果具有鉴别诊断价值[5-6]。TAA自身抗体是恶性肿瘤细胞在发展过程中激活细胞和免疫系统产生抗肿瘤细胞抗原的自身抗体，释放入血，在血清中稳定存在。本组7种自身抗体有大量基础研究报道，并已应用于临床，其检测准确、迅速，结果可靠。

本实验回顾性分析848例标本，非小细胞肺癌组7种自身抗体中有6项指标检测水平高于对照组，仅PGP9.5除外。本组结果提示7种自身抗体联合检测能有效鉴别非小细胞肺癌患者与健康人群，与国内外相关报道基本一致[7-8]。

文献报道[9-10]7种自身抗体中p53在肿瘤组中的阳性率最高，其属于抑癌基因，在多种肿瘤中存在异常表达和突变。有研究发现，p53在肺癌患者中有突变和表达异常[11]，蔡学琴等[12]报道肺癌患者血清及胸水中p53抗体水平高于对照组，这可能是导致肺癌患者p53升高的原因之一。PGP9.5抗体在肺癌组和对照组的阳性率均较低，说明该抗体在人群中呈低表达，故无法区分肿瘤患者与非肿瘤患者。应用联合检测非小细胞肺癌组的阳性率显著高于对照组，进一步提示联合检测能有效鉴别肿瘤人群与健康人群。

一种肿瘤生物学标志物或一种实验方法能否有效用于肿瘤的筛查、诊断与鉴别诊断，其诊断效能的评价必不可少[13]。应用ROC曲线分析自身抗体的敏感性、特异性，评价其诊断效能是临床上常用的方法。本组ROC曲线绘制结果表明，单个应用每种自身抗体，其敏感性、特异性参差不齐，应用价值不高。本组联合检测可明显提升其AUC至0.751，且联合检测敏感性56.66%、特异性93.58%，提示联合检测具有更高的诊断效能。

本组进一步分析发现，联合检测7种自身抗体在非小细胞肺癌中的阳性率与患者年龄、性别、肿瘤大小、病理类型、淋巴结转移等临床病理特征均无关；与PD-L1的表达有显著相关性。ALK和PD-L1是肺癌免疫组化检测的常用指标，若发生ALK基因重排(EML4-ALK)，可促使肺癌发生和进展[14-15]，文献报道ALK阳性占非小细胞肺癌的5%～7%[16]，本组为1.93%(8/414)。克唑替尼(Crizotinib)是治疗ALK阳性非小细胞肺癌有效的靶向药物，本组未发现7种自身抗体联合检测的阳性率与ALK阳性率有相关性。PD-L1是近年分子靶向治疗的新热点[17]，有研究显示PD-1/PD-L1在非小细胞肺癌组织中的表达与临床病理特征及预后有相关性[18]。本组发现联合检测7种自身抗体的阳性率与PD-L1的表达差异有显著性，PD-L1阳性者的自身抗体阳性率更高。临床实验表明PD-1/PD-L1的表达可为临床用药提供参考[19]，本实验结果提示肺癌自身抗体的表达水平与PD-L1有相关性，但能否为PD-1/PD-L1抑制剂的用药作为参考，还需要进一步试验证实。

综上所述，联合检测7种自身抗体有助于临床医师对肺癌高危人群的诊断和鉴别诊断。但该方法仍为重要辅助手段之一，临床、病理医师还需结合患者的临床特点、影像学特征、病理活检等多种手段综合判断。