PXMP4促进结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭

2021-04-01贺国洋赵文丽王永强朱会芳王永霞千新来

临床与实验病理学杂志 2021年2期

贺国洋，李巍，周琳，赵文丽，王永强，朱会芳，李娜，崔静，王永霞，千新来

目前，结直肠癌的发病率呈逐年上升且年轻化趋势，严重威胁人类健康[1]，其中20%～40%的结直肠癌患者确诊时已经合并远处转移。转移是导致结直肠癌患者死亡的主要原因[2-4]。过氧化物酶体膜蛋白4(peroxisomal membrane protein 4, PXMP4)基因定位于20q11.12，编码含212个氨基酸的多通道跨膜蛋白，是PXMP2/4家族的重要成员[5-6]。现阶段PXMP4在结直肠癌中作用及其机制尚未见报道。本实验旨在探讨PXMP4对结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭的影响，为结直肠癌的早期诊断和靶向治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂收集2013～2017年新乡医学院第三附属医院结直肠癌标本和距肿瘤边缘≥5 cm正常肠黏膜组织各112例。纳入标准：患者术前均未行放、化疗和免疫治疗，具有手术治疗适应症，符合结直肠癌手术病理学诊断标准。人结直肠癌细胞株购自中科院上海细胞库，构建PXMP4-HA过表达质粒，干扰片段购自广州锐博公司。E.Coli DH5α大肠杆菌为本实验室自存。Lipofectamine 2000、RPMI 1640培养基和胎牛血清购自Invitrogen公司；反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒购自大连Takara公司；引物购自美国Invitrogen公司；抗PXMP4抗体购自美国Abcam公司；抗HA抗体和Tublin抗体均购自赛默斯生物公司。PBS缓冲液、柠檬酸钠抗原修复液、胰蛋白酶、Western blot一抗稀释液、凝胶配制试剂盒、PMSF、RIPA裂解液BCA蛋白浓度测定，均购自上海碧云天公司；Transwell小室购自美国康宁公司；CCK-8购自日本同仁科技公司。

1.2 方法

1.2.1生物信息学数据处理登录Oncomine数据库(https://www.oncomine.org/resource/login.html)，在搜索框中输入基因名“PXMP4”，选择Cancer type：Colorectal cancer，点击Gaedcke Colorectal数据进入数据获取页面并下载数据，分析PXMP4在结直肠癌及正常肠黏膜组织中的表达。

1.2.2免疫组化采用免疫组化SP法染色，标本均经4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片，脱蜡，水化，PBS清洗。高压修复、室温冷却，PBS清洗，加入3%H2O2阻断内源性过氧化氢酶，PBS冲洗3次。山羊血清封闭1 h，甩干血清后，直接加入PXMP4特异性抗体，于4 ℃冰箱孵育过夜。次日，室温下放置1 h。滴加山羊抗兔二抗，37 ℃孵育30 min，PBS清洗，DAB显色，苏木精复染、流水蓝化、梯度乙醇脱水、二甲苯透明，中性树胶封固。应用半定量积分法进行染色细胞判读，随机选取10个高倍视野。(1)根据阳性细胞百分数计分：阳性细胞数≤25%为1分，26%～50%为2分，>50%为3分；(2)根据阳性细胞染色强度计分：未着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分[7]。将两项得分结果相乘：0～3分为阴性，4～6分为阳性。

1.2.3细胞培养与转染人结直肠癌细胞株均用含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L链霉素的RPMI 1640培养基，于5%CO2的37 ℃恒温箱中培养。过表达组：空细胞组、空载组、PXMP4-HA组。干扰组：空细胞组、阴性对照组、干扰片段1组/2组/3组。转染前对结直肠癌细胞株进行传代，计数8.0×105个细胞均匀接种于6孔板中，使用无双抗的培养基培养，待细胞生长密度约70%时，再行细胞转染。按照Lipofectamine 2000使用说明书制备A液与B液混匀，室温静置20 min后加入6孔板中，总体积为2 μL。置于5%CO2的37 ℃恒温箱中孵育6 h，更换为正常培养基24 h，收集细胞进行后续实验。

1.2.4Western blot法本实验提取细胞总蛋白，BCA法测蛋白浓度。取已变性蛋白质30 μg和5 μL蛋白预染Marker，行SDS-PAGE凝胶电泳后移至PVDF膜，用5%脱脂牛奶室温封闭1～2 h。加入一抗(1 ∶500)，4 ℃摇床孵育过夜，TBST清洗3次；加入二抗(1 ∶2 000)摇床室温孵育2 h，TBST清洗3次，ECL发光成像。

1.2.5RT-PCR实验提取细胞总RNA，Nanodrop 2000核酸蛋白测定仪检测RNA浓度和纯度，使用Takara反转录试剂盒将RNA转录成为cDNA。反应条件：37 ℃ 15 min；85 ℃ 5 s。按Takara荧光定量试剂盒说明书操作步骤进行PCR扩增。反应条件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s。用 2-ΔΔCt法计算PXMP4 的相对表达量，实验重复3次。引物序列：GAPDH上游引物：5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′，下游引物：5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′；PXMP4上游引物：5′-TGTCGCCACAGGACCGGAA-3′，下游引物：5′-CAACTCATTGGAGTTGTTGC-3′。PXMP4三个干扰片段序列分别为：si-1(CGCTGGT CATGACCTTTCT)、si-2 (GTTGTCACGCGTCCTGTTT)、si-3 (CTGCGTTGGCCGTGCTTAA)。

1.2.6CCK-8检测细胞增殖将转染24 h后的各组细胞以1×103个/孔接种于96孔板中，每孔100 μL，每组设3个重复孔。分别在1～6天向每孔加入10 μL的CCK-8，继续培养2 h，用酶标仪测量每孔在波长450 nm处吸光度(A450)，以时间为横坐标，A450值为纵坐标，绘制细胞生长曲线，实验重复3次。

1.2.7划痕愈合实验和Transwell实验检测细胞迁移和侵袭细胞常规消化和铺板，待细胞长至80%，用10 μL枪头在6孔板中的背后平行划3条线，然后孔内沿着与孔板背面线垂直的方向划3条线，用PBS清洗细胞2次，加入2 mL的无血清培养基，分别于0、24、48 h在同一划线相交处进行拍照记录。

收集上述转染过的细胞，计数4×104个细胞，用200 μL无血清培养基重悬，加入Transwell细胞培养板的小室上室(加基质胶)，下室加入500 μL含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液。每组设3个复孔。在37 ℃、含5%CO2的孵箱中培养48 h后，用棉签轻轻拭去微孔膜上层的细胞，用4%多聚甲醛溶液固定下层细胞20 min，PBS冲洗3次；再用0.1%结晶紫染色液室温染色10 min，PBS冲洗3次，随机选取5个视野，光镜下计数穿膜并黏附在膜下表面的细胞拍照记录。

2 结果

2.1 结直肠癌中PXMP4的表达生物信息学结果表明：65例结直肠癌组织中有64例PXMP4 mRNA的相对表达量显著高于正常肠黏膜组织，差异有统计学意义(P<0.001，图1)。免疫组化结果表明：PXMP4主要定位于细胞器膜上，染色呈强阳性，为棕褐色颗粒。本实验结直肠癌组织中PXMP4的阳性率为71.429%(80/112)，高于正常肠黏膜组织(5.4%，6/112)，差异有统计学意义(P<0.05，图2)。

2.2 结直肠癌中PXMP4表达与临床病理特征的关系本组结果表明：低分化组与高中分化组结直肠癌相比，低分化组中PXMP4蛋白表达升高(P<0.05)；有淋巴结转移组与无淋巴结转移组相比，有淋巴结转移组中PXMP4蛋白表达升高(P<0.05)。PXMP4蛋白表达与患者性别、年龄和肿瘤大小均无相关性(P>0.05，表1)。

图1 A.PXMP4 mRNA在结直肠癌和正常肠黏膜组织中表达；B.PXMP4 mRNA在结直肠癌和正常肠黏膜组织中表达分析

图2 A.正常肠黏膜组织中PXMP4表达，SP法；B.结直肠癌组织中PXMP4表达，SP法

表1 结直肠癌中PXMP4表达与临床病理特征的关系

2.3 过表达/干扰PXMP4结直肠癌的细胞株效率本组经Western blot和RT-PCR检测6株结直肠癌细胞中PXMP4内源性表达：高表达PXMP4的HCT116和SW620用于构建干扰细胞株，低表达PXMP4的RKO和SW480用于构建过表达细胞株(图3A)。Western blot和RT-PCR结果显示：与空细胞组和空载组相比，PXMP4-HA组PXMP4的表达显著升高(P<0.05，图3B)；与空细胞组和阴性对照组相比，干扰片段3组PXMP4的表达显著降低(P<0.05，图3C)，后续使用干扰片段3组进行功能实验。

2.4 过表达/干扰PXMP4对结直肠癌细胞增殖的影响本组结果显示：PXMP4-HA组与空细胞组和空载组相比，PXMP4-HA组细胞生长速度增快(P<0.05，图4A、B)；与空细胞组和阴性对照组相比，干扰片段3组细胞生长速度降低(P<0.05，图4C、D)。

2.5 过表达/干扰PXMP4对结直肠癌细胞迁移的影响本组结果显示：PXMP4-HA组与空载组相比，其细胞迁移速度增快(P<0.05，图5A)；干扰片段3组与阴性对照组相比，其细胞迁移速度降低(P<0.05，图5B)。

2.6 过表达/干扰PXMP4对结直肠癌细胞侵袭的影响本组结果显示：PXMP4-HA组与空载组相比，其细胞穿过小室基膜的细胞数显著增加(P<0.05，图6A)；干扰片段3组与阴性对照组相比，其细胞穿过小室基膜的细胞数显著减少(P<0.05，图6B)。

3 讨论

结直肠癌是全球常见的癌症之一，病死率仅次于肺癌、肝癌和胃癌。结直肠癌患者的治疗以手术切除为主，但术后仍有复发和转移[1-4]。目前，结直肠癌的发生机制尚未完全阐明，因此探讨结直肠癌发病机制已成为研究热点。

过氧化物酶体存在所有真核细胞的基本细胞器中，含有一系列生物化学反应所需的酶类，在多种细胞分解代谢和合成代谢途径中起重要作用[8-9]。编码过氧化物酶体蛋白的人类基因缺陷可能导致不同的过氧化物酶体功能紊乱。PXMP4是过氧化物酶体固有膜蛋白。据国外文献报道PXMP4的5′-CPG区胞嘧啶甲基化后沉默PXMP4 mRNA的表达，即PXMP4在前列腺上皮细胞中和雄激素依赖的前列腺癌细胞中表达，而在雄激素非依赖的前列腺癌细胞中不表达。PXMP4启动子区的甲基化可能是一种分子机制参与其过程[10-11]。DNA甲基化介导的PXMP4转录沉默在雄激素依赖的前列腺癌向雄激素非依赖的前列腺癌转变中起重要作用[12-14]。研究发现单个内含子CpG二核苷酸通过DNA甲基化在PXMP4基因调控中的关键作用，提示甲基化介导的PXMP4沉默是与前列腺癌发生相关的分子事件，表明PXMP4在前列腺癌中作为一种抑癌基因发挥其抗肿瘤作用[15-17]。目前，PXMP4在结直肠癌中的作用报道较少。本组通过生物信息学分析发现PXMP4是正常结直肠和癌组织的差异表达基因。免疫组化证实PXMP4蛋白的表达在结直肠癌组织中显著增强，其与肿瘤分化及有无淋巴结转移密切相关。构建过表达/干扰PXMP4的结直肠癌细胞株实验表明：过表达PXMP4能促进结直肠癌细胞增殖、侵袭和迁移，干扰PXMP4能抑制结直肠癌细胞增殖、侵袭和迁移。