右美托咪定调控miR-126对高糖诱导的心肌细胞氧化应激及凋亡的影响

孔建强 邴淼 汪琼 汪建胜

(上海市宝山区中西医结合医院麻醉科, 上海 宝山 201999)

糖尿病是临床常见的疾病之一，其中大部分患者均伴有心血管疾病，而氧化应激损伤在糖尿病所致的心血管疾病中发挥重要作用，因而减轻心肌细胞氧化应激损伤有助于提高糖尿病性心血管疾病的治疗效果[1-2]。目前关于糖尿病性心血管疾病尚无理想治疗药物，因而寻找安全性高且毒性较小的药物已然成为研究重点[3-4]。有研究[5]表明右美托咪定(Dexmedetomidine，DEX)可抑制烫伤大鼠心肌细胞凋亡。但DEX在糖尿病性心血管疾病中的治疗效果及作用机制尚未完全阐明。孟佩盈等[6]研究显示微小RNA-126(microRNA-126，miR-126)在2型糖尿病伴冠心病患者中呈低表达，其表达量与冠状动脉病变严重程度密切相关。因此，本研究采用高糖处理心肌细胞，探讨DEX对心肌细胞氧化应激及凋亡的影响，分析其对miR-126的调控作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 大鼠心肌细胞H9C2购自美国ATCC公司，DEX购自江苏恒瑞医药股份有限公司，葡萄糖购自山东祥瑞药业有限公司，杜氏改良培养基(DMEM)、胎牛血清购自美国Gibco公司，胰蛋白酶、Lipofectamine2000购自美国Invitrogen公司，乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所，膜联蛋白V(Annexin V)-异硫氰酸荧光素(FITC)/碘化丙啶(PI)细胞凋亡试剂盒购自北京博迈斯科技发展有限公司，Trizol试剂购自北京全式金生物技术有限公司，反转录试剂盒与实时荧光定量PCR试剂盒购自北京天根生化科技有限公司，miR-126寡核苷酸模拟物(miR-126 mimics)及阴性对照mimic NC序列(miR-NC)、miR-126特异性寡核苷酸抑制剂(anti-miR-126)及其阴性对照(anti-miR-NC)购自上海吉玛制药技术有限公司，RIPA裂解液购自上海士锋生物科技有限公司，二喹啉甲酸(bicinchoninicacid，BCA)蛋白定量检测试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司，兔抗鼠半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶3的前体蛋白(pro-caspase-3)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cl-caspase-3)抗体购自美国Santa Cruz公司，辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔二抗购自美国Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 实验分组 取对数期心肌细胞接种于6孔板中，分别用葡萄糖浓度为5.5、35 mmol/L的DMEM培养基培养，分别记为对照组、高糖损伤模型组。分别使用不同浓度(5、10、20 μg/L )DEX处理心肌细胞，置于含有葡萄糖浓度为35 mmol/L的DMEM培养基培养24 h，分别记作实验1组、实验2组、实验3组。参照Lipofectamine2000试剂说明书分别将miR-NC、miR-126 mimics转染至心肌细胞，使用含有葡萄糖浓度为35 mmol/L的DMEM培养基培养24 h，分别记为miR-NC组、miR-126组。参照Lipofectamine 2000试剂说明书分别将miR-NC、miR-126 mimcis、anti-miR-NC、anti-miR-126转染至心肌细胞，使用含有葡萄糖浓度为35 mmol/L与DEX浓度为20 μg/L的 DMEM培养基培养24 h，分别记作实验3+miR-NC组、实验3+miR-126组、实验3+anti-miR-NC组、实验3+anti-miR-126组。

1.2.2 检测LDH、MDA、SOD的含量 取对数期心肌细胞(3×104个/mL)接种于96孔板(100 μL/孔)，按照“1.2.1”实验分组处理后，收集细胞，按照试剂盒说明书检测LDH、MDA、SOD的含量，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.2.3 流式细胞术检测细胞凋亡率 收集各组对数期心肌细胞，预冷PBS洗涤，4 ℃条件下经1000 r/min离心10 min，加入500 μL结合缓冲液，依次加入5 μL Annexin V-FITC与5 μL PI，充分混匀，室温振荡摇晃孵育10 min，应用FACS Calibur流式细胞仪及Cellauest软件检测各组细胞凋亡率。

1.2.4 实时荧光定量聚合酶链反应(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)检测细胞中miR-126的表达水平 收集各组对数期心肌细胞，采用Trizol法提取细胞中的总RNA。应用Nanodrop2000c超微量分光光度计检测RNA浓度与纯度，RNA OD260/OD280处于1.8～2.0。参照反转录试剂盒将RNA反转录合成cDNA，miR-126正向引物5′-GGCTTCGTACCG TGAGTAAT-3′，反向引物5′-GTGCAGGGTCCGA GGT-3′；U6正向引物5′-GCTTCGGCAGCACATA TACT-3′，反向引物5′-GTGCAGGGTCCGAGGTA TTC-3′。引物由上海生工生物工程股份有限公司设计合成。以cDNA为模板进行qRT-PCR扩增，反应体系：10×PCR Buffer 2.5 μL，MgSO42.5 μL，dNTPs 2.5 μL，正反向引物各0.5 μL，cDNA 2 μL，RNase-Free ddH2O补足体系至25 μL。反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40次循环。miR-126以U6为内参，采用2-ΔΔCt法计算miR-126相对表达量。

1.2.5 蛋白免疫印迹(Western blot)检测pro-caspase-3、cl-caspase-3蛋白水平 收集各组对数期心肌细胞，加入适量RIPA裂解液提取细胞总蛋白。采用BCA法测定蛋白浓度，严格按照试剂盒说明书进行操作。采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白，将分离的蛋白凝胶转移至PVDF膜，室温封闭2 h，加入一抗稀释液(pro-caspase-3稀释比1:1000、cl-caspase-3稀释比1∶1000，内参GAPDH1∶1000)，4 ℃孵育过夜，TBST洗涤，加入二抗稀释液(1∶5000)，室温孵育1 h，TBST洗涤，暗室内曝光显影，应用ImageJ软件分析各条带灰度值。

2 结果

2.1 右美托咪定对高糖诱导心肌细胞氧化应激的影响 与对照组比较，高糖损伤模型组LDH、MDA含量显著升高(P<0.05)，SOD含量显著降低(P<0.05)；与高糖损伤模型组比较，实验1组、实验2组、实验3组LDH、MDA含量显著降低(P<0.05)，SOD含量显著升高(P<0.05)，实验1组、实验2组、实验3组间LDH、MDA、SOD的含量比较差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 LDH、MDA、SOD的含量

2.2 右美托咪定对高糖诱导心肌细胞凋亡及miR-126表达的影响 与对照组比较，高糖损伤模型组miR-126的表达水平显著降低(P<0.05)，细胞凋亡率显著升高(P<0.05)，cl-caspase-3蛋白水平显著升高(P<0.05)，pro-caspase-3蛋白水平显著降低(P<0.05)；与高糖损伤模型组比较，实验1组、实验2组、实验3组miR-126的表达水平升高(P<0.05)，细胞凋亡率显著降低(P<0.05)，cl-caspase-3蛋白水平显著降低(P<0.05)，pro-caspase-3蛋白水平显著升高(P<0.05)，实验1组、实验2组、实验3组间各指标比较差异均具有统计学意义(P<0.05)，见表2、图1。

表2 右美托咪定对高糖诱导心肌细胞凋亡的影响

图1 右美托咪定对高糖诱导心肌细胞凋亡及蛋白表达的影响

2.3 过表达miR-126对高糖诱导心肌细胞氧化应激和凋亡的影响 与miR-NC组比较，miR-126组LDH、MDA含量显著降低(P<0.05)，SOD含量显著升高(P<0.05)，细胞凋亡率显著降低(P<0.05)，cl-caspase-3蛋白水平显著降低(P<0.05)，pro-caspase-3蛋白水平显著升高(P<0.05)，见图2、表3。

图2 miR-126对高糖诱导心肌细胞凋亡及蛋白表达的影响

表3 miR-126对高糖诱导心肌细胞氧化应激和凋亡的影响

2.4 miR-126对右美托咪定作用的高糖诱导心肌细胞氧化应激、凋亡的影响 与实验3+miR-NC组比较，实验3+miR-126组LDH、MDA含量显著降低(P<0.05)，SOD含量显著升高(P<0.05)，细胞凋亡率显著降低(P<0.05)，cl-caspase-3蛋白水平显著降低(P<0.05)，pro-caspase-3蛋白水平显著升高(P<0.05)；与实验3+anti-miR-NC组比较，实验3+anti-miR-126组LDH、MDA含量显著升高(P<0.05)，SOD含量显著降低(P<0.05)，细胞凋亡率显著升高(P<0.05)，cl-caspase-3蛋白水平显著升高(P<0.05)，pro-caspase-3蛋白水平显著降低(P<0.05)，见图3、表4。

图3 miR-126对右美托咪定作用的高糖诱导心肌细胞凋亡及蛋白表达的影响

表4 miR-126对右美托咪定作用的高糖诱导心肌细胞氧化应激、凋亡的影响

3 讨论

糖尿病患者体内持续的高血糖水平可增加心血管疾病的发生风险，高血糖可通过氧化应激及诱导细胞凋亡从而对心肌组织造成损伤。既往研究[7-8]显示miRNA在高糖诱导的心肌细胞中表达异常并可能参与心肌细胞损伤过程。目前关于糖尿病性心血管疾病的治疗药物成为重点研究，因此本研究积极探寻新型治疗药物并分析其可能作用机制。

DEX可抑制LPS诱导的心肌细胞炎症反应从而减轻心肌损伤[9]。有研究[10]表明DEX可通过抑制心肌细胞凋亡从而改善大鼠心肌缺血-再灌注损伤后的心室功能。另有相关报道[11]指出DEX可抑制抗链尿佐菌素诱导的糖尿病大鼠心肌氧化应激及细胞凋亡。氧化应激指标主要包括LDH、MDA、SOD，心肌细胞氧化损伤时LDH含量增加，SOD属于抗氧化酶类，并可通过协调氧化与抗氧化平衡从而保护心肌细胞免受氧化应激损伤，MDA属于氧化酶类并可作为脂质过氧化的标志物，还可反应细胞氧自由基损伤的严重程度[12-17]。本研究结果显示高糖处理后心肌细胞中LDH、MDA含量显著升高，SOD含量显著降低，不同浓度的DEX处理后LDH、MDA含量显著降低，SOD含量显著升高，提示DEX可减轻高糖诱导的心肌细胞氧化损伤，且呈剂量依赖效应。

细胞接受凋亡信号时，caspase级联反应被激活后可促进caspase-3活化形成cl-caspase-3，cl-caspase-3表达上调可促进细胞凋亡，而pro-caspase-3表达上调可抑制细胞凋亡[8-19]。本研究结果显示高糖处理后心肌细胞凋亡率显著升高，cl-caspase-3表达上调，pro-caspase-3表达下调，而不同浓度的DEX处理后心肌细胞凋亡率显著减低，cl-caspase-3表达下调，pro-caspase-3表达上调，提示DEX可能通过调控细胞凋亡相关蛋白表达从而抑制高糖诱导的心肌细胞凋亡。

研究[20]表明miR-126可抑制急性心肌梗死大鼠心肌细胞凋亡。miR-126表达量降低与心肌缺血再灌注损伤发生密切相关[21]。本研究结果显示高糖处理后心肌细胞中miR-126的表达下调，DEX处理后可明显促进miR-126的表达，且呈剂量依赖效应，进一步研究显示miR-126过表达后LDH、MDA含量降低，SOD含量升高，细胞凋亡率降低，cl-caspase-3表达下调，pro-caspase-3表达上调，提示miR-126过表达可增强高糖诱导的心肌细胞抗氧化能力并抑制心肌细胞凋亡。为探究DEX是否通过调控miR-126的表达从而影响高糖诱导心肌细胞氧化应激、凋亡。本研究分别将miR-126 mimics、anti-miR-126转染至心肌细胞，使用DEX与高糖共同处理，结果显示miR-126过表达能增强DEX对高糖诱导心肌细胞氧化应激、凋亡的作用，抑制miR-126表达能减弱DEX对高糖诱导心肌细胞氧化应激、凋亡的作用，提示DEX可能通过上调miR-126表达从而抑制高糖诱导心肌细胞氧化应激及细胞凋亡。但本研究仍需通过体内实验验证DEX对心肌细胞氧化应激损伤及细胞凋亡的作用及分子机制。

4 结论

本研究结果显示，DEX可通过调控miR-126表达保护心肌细胞免受高糖诱导的氧化应激损伤，可为糖尿病性心血管疾病的治疗提供了新方向。