PM2.5对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化的影响及机制*

2021-04-01赵培刘晶于芳于悦卿高伟路永刚李永辉帖彦清

西部医学 2021年3期

赵培刘晶于芳于悦卿高伟路永刚李永辉帖彦清

(1.河北省人民医院检验科，河北石家庄 050051；2.河北省人民医院内分泌科，河北石家庄 050051；3.河北省疾病预防控制中心，河北石家庄 050051)

近年来石家庄市空气污染严重，特别是PM2.5颗粒物含量高，心血管疾病多发，这两种现象可能有因果关系，引起了广泛的社会关注[1-2]。动脉粥样硬化是心血管疾病的主要病理学改变，被认为是一种慢性炎症性疾病，循环中的白细胞参与该慢性炎症反应。研究认为PM2.5能够避开呼吸系统屏障进入血液循环，扰乱先天免疫机制[3-4]。在PM2.5的刺激下血管内皮细胞损伤，引起与动脉粥样硬化相关的各种炎症因子、趋化因子及黏附因子的释放，在这些细胞因子的作用下，循环中的单核细胞迁移到病变血管内膜处并向内皮下移动分化为巨噬细胞，吞噬周围的脂质成分等相关物质形成泡沫细胞，同时在适宜的微环境作用下促进血管动脉粥样硬化斑块的进展[5]。本研究旨在探讨PM2.5能否加速ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化的发生、发展并探讨其相关分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料 SPF级8周龄体质量(20±2)g、ApoE-/-小鼠购自卡文斯实验动物有限公司(中国常州)[生产许可证号SCXK(苏)2016-0010]，饲养于河北省人民医院临床研究中心SPF级动物房(温度：20～24 ℃，湿度：45%～55%)，每笼5～6只。采用高脂饮食喂养8周(含21%脂肪、19.5%酪蛋白和1.25%胆固醇)。动物实验在河北省人民医院实验动物中心[SYXK(冀)2015-0065]进行。该动物实验经过了河北省人民医院医学伦理委员会的批准(201922)，实验严格遵循3R原则给予人道关怀。PM2.5准备：采用TH-150D型智能中流量空气总悬浮颗粒物采样器24 h连续中流量采样进行细颗粒物(PM2.5)的收集。将收集的PM2.5采用液氮冷冻干燥成粉末后于黑暗中4 ℃下储存。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组与造模处理将ApoE-/-小鼠随机分为PM2.5组(n=16)和对照组(n=16)。小鼠PM2.5用量参考石家庄地区正常成人每天PM2.5吸入量(2017年石家庄平均PM2.5为65 μg/m3)。每天将10 mg的PM2.5粉末悬浮在4.8 mL的生理盐水中，PM2.5组每只小鼠每天气管滴注0.3 mL PM2.5混悬液一次，对照组气管滴注相同剂量的生理盐水。

1.2.2 小鼠全血重金属测定小鼠眼球取血，采用电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS， Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA)测定全血的重金属含量，同时测定小鼠气管滴注所用的PM2.5混悬液的重金属含量。

1.2.3 主动脉根部斑块面积及成分分析主动脉根部切成5 μm的石蜡切片进行Movat染色，评估斑块大小。天狼星红染色后，评价斑块内的胶原含量的变化。抗mac-2、α-肌动蛋白抗体免疫组化染色检测斑块内的巨噬细胞Mφ(galectin-3/MAC-2)、平滑肌细胞(β-actin)的变化。

1.2.4 降主动脉斑块内部炎症因子基因表达检测使用Trizol两步法抽提降主动脉的总RNA，按照逆转录试剂说明书进行实时荧光定量PCR。斑块内部相关因子及内参基因荧光定量PCR反应引物序列，见表1。

2 结果

2.1 小鼠血液中重金属含量测定 PM 2.5组全血中重金属含量显著升高，特别是铝、钒和铁(表2)；PM2.5组小鼠的全血重金属比例与PM2.5混悬液相似(表3)。表明PM2.5重金属颗粒可以通过气管滴注法进入ApoE-/-小鼠循环系统。

表2 两组小鼠血液中重金属含量比较

表3 PM2.5混悬液重金属的成分和含量(μg/L)

2.2 PM2.5对斑块的影响 PM2.5处理后动脉根部斑块面积显著增加，斑块中巨噬细胞数量增加，斑块中的胶原含量降低(P<0.05)，平滑肌数量无明显变化(P>0.05)，见图1、表4。提示PM2.5促进ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化发展。

图1 PM2.5处理对小鼠斑块面积以及细胞成分的影响

表4 两组主动脉根部斑块面积及成分比较

2.3 PM2.5对动脉粥样斑块中炎症因子基因表达的影响与对照组比较，PM2.5组IL-6、Lp-PLA2、MCP-1及ICAM-1、iNOS和IL-12的表达显著增加(P<0.05)，CD206和Arg-1表达下降(P<0.05)(表5)。

3 讨论

动脉粥样硬化是一种以脂质堆积和纤维斑块形成为特征的在动脉管壁发生的慢性、低水平的炎症性疾病。白细胞，主要是单核细胞和巨噬细胞，是先天炎症免疫的主要组成部分，是抵御异物的第一道防线[6]。近年来大气污染中PM2.5成分可看作是一种触发人体炎症免疫反应的一种异物。研究[7-8]发现，短期暴露于高浓度或长期暴露于低浓度PM2.5是AS进展的一个危险因素，在持续的PM2.5刺激下，这种免疫炎症反应可能变得持续和慢性，但其作用机制尚未完全阐明。

表5 两组降主动脉炎症性因子基因表达比较

Lp-PLA2是磷脂酶超家族中的亚型之一，也被称为是血小板活化因子乙酰水解酶，由血管内膜中的巨噬细胞、T细胞和肥大细胞分泌。Lp-PLA2可水解氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)中的氧化磷脂，生成脂类促炎物质，如溶血卵磷脂和氧化游离脂肪酸，这些物质可导致血管内皮损伤，刺激产生粘附因子和细胞因子，这些物质可通过趋化炎症细胞进一步产生自我强化的循环，生成更多促炎物质，加速AS的进展[9]。秦召敏等[10]研究发现Lp-PLA2是冠心病发生的危险因素，而且与冠心病的严重程度呈正相关。本研究发现，PM2.5处理后，ApoE-/-小鼠血管动脉硬化斑块内Lp-PLA2表达增强，这可能与PM2.5刺激ApoE-/-小鼠血管内膜中巨噬细胞活化，分泌产生更多的Lp-PLA2有关。

细胞间黏附分子-1 (intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)，又叫做CD54，属于黏附分子中免疫球蛋白超家族(IGSF)中的成员，是介导黏附反应重要的一个黏附分子。ICAM-1 在静息的血管内皮细胞上呈低水平表达，通过与血管内皮细胞表面上的特异性受体结合而发挥其生物学活性。作为白细胞和内皮细胞跨膜的蛋白质，ICAM1在稳定细胞间相互作用和促进白细胞和内皮细胞的迁移起到重要作用。有研究[11]发现，ICAM-1与正常血压糖尿病患者动脉粥样硬化程度呈正相关。国内外多项研究[12-13]表明，PM2.5能够直接引起血管内皮细胞的损伤，而血管内皮细胞受损是动脉粥样硬化起始的条件之一，受损的血管内皮细胞能够促使细胞黏附分子(如ICAM-1)的表达增加，细胞粘附分子及其受体之间的相互作用将信号传递到单核细胞中，并导致单核细胞迁移到血管内皮下，摄取ox-LDL，变为激活的巨噬细胞，并分化为泡沫细胞，参与动脉粥样硬化斑块的形成和发展。

激活的巨噬细胞能够分泌IL-6，其能够通过激活核因子-κB(nuclear factor，NF-κB)，使炎症介质和细胞因子的基因转录增强，可促使斑块内单核/巨噬细胞、内皮细胞和平滑肌细胞等分泌MCP-1[14]，从而促使更多的单核细胞聚集、浸润，并迁移至血管内皮下吞噬脂质，形成泡沫细胞，从而加速AS的进展[15]。MCP-1又能活化白细胞并介导其产生炎性介质IL-6，并促进内皮细胞更多地分泌趋化因子MCP-1，形成瀑布效应，最终导致AS病变的发生、发展[16]。王冬莲等[17]研究发现血清MCP-1水平与AS严重程度有关，并反映了病情的严重程度，可以作为初步预测急性冠脉事件和判断AS严重程度的参考指标。急性感染、慢性炎症性疾病、肥胖和生理应激反应均可促进IL-6的释放，动脉粥样硬化始于内皮损伤，炎症参与动脉粥样硬化整个过程[18]。Zamani等[18]证实IL-6可以促进动脉粥样硬化斑块的发展和破裂。张涛等[19]研究发现，在99例高血压患者中，IL-6水平较高的一组患者颈动脉斑块内-中膜厚度及斑块面积均高于对应低水平组患者。

在动脉粥样硬化的发生和发展过程中，血管内皮屏障首先被破坏，并进一步表达粘附因子和受体，导致白细胞(特别是单核细胞)进一步的聚集和活化。循环白细胞(特别是单核细胞)迁移至损伤的血管内皮细胞处不可逆地分化为巨噬细胞[20]。已知巨噬细胞有两种亚型，第一种为经典活化性，这类巨噬细胞能够合成大量的促炎细胞因子(iNOS、IL-12)，促炎细胞因子刺激白细胞的募集、活化、分化和存活，能够促进动脉粥样硬化的发生、发展；第二种是替代活化型的巨噬细胞(M2)，其分泌的细胞因子(Arg-1和CD206)具有抗动脉粥样硬化的作用。为探知PM2.5对巨噬细胞亚型的影响，我们进一步检测了动脉斑块内iNOS、IL-12、Arg-1和CD206的表达，发现iNOS和IL-12表达上调(P<0.05)，Arg-1和CD206的表达下调(P<0.05)，表明在PM2.5的作用下，斑块内巨噬细胞更多地转化为M1型，促进了动脉粥样硬化的发生、发展。