抑制线粒体动力相关蛋白1通过PI3K/AKT通路对糖尿病大鼠七氟醚后处理心肌细胞凋亡的影响*

程虎 陈婷婷 亚力·亚森 吴建江

(新疆医科大学第一附属医院麻醉科，新疆 乌鲁木齐830054)

七氟醚(sevoflurane，Sev)具有快速诱导麻醉，对肝、肾功能影响小及稳定的血液动力学等特点，在麻醉中广泛使用；Sev后处理对心肌细胞具有保护作用，其对糖尿病(diabetic mellitus，DM)患者心肌细胞的保护作用显著减弱[1-2]。线粒体动力相关蛋白1(dynamin-related protein 1，Drp1)被激活后募集在线粒体表面，并促进线粒体分裂。研究[3]发现，抑制Drp1可以减轻DM小鼠心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)损伤。磷脂酰肌醇激酶3(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)相关通路在I/R中发挥重要作用。研究[4]显示促进PI3K/AKT通路可以保护DM大鼠的心肌细胞。本文主要分析Drp1通过PI3K/AKT通路对DM大鼠Sev后处理心肌细胞凋亡的影响，并探究其机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料和仪器 健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(12周，220～250 g，上海斯莱克实验动物中心，中国)。链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)(Sigma公司，美国)。Drp1 抑制剂 Mdivi-1 (Med Chem Expres公司，美国)。生化试剂盒、酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒和TDT介导的dUTP-生物素缺口末端标记(TUNEL)试剂盒(碧云天公司，中国)。小动物呼吸机(Inspira ASV，哈佛仪器公司，美国)。BL-420F小动物生物功能实验系统(成都泰盟科技有限公司，中国)。Mayer's苏木精和0.5%曙红水溶液(H8070，DH0050，北京Solarbio公司，中国)。RIPA裂解缓冲液(中国，北京，Beyotime)、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)试剂盒(武汉博斯特生物技术有限公司，中国)、抗体购自美国Abcam公司、聚偏氟乙烯(PVDF)膜(Bio-Rad公司，美国)、显微镜(Olympus 公司，日本)。

1.2 大鼠分组、建模和干预方法 将60只大鼠随机分为假手术(Sham)、I/R、I/R+DM、I/R+DM+Sev、I/R+DM+Sev+Mdivi-1、I/R+DM+Mdivi-1组6组。其中I/R+DM、I/R+DM+Sev、I/R+DM+Sev+Mdivi-1、I/R+DM+Mdivi-1组通过腹腔注射STZ(60 mg·kg-1，pH=4.5)建立糖尿病模型，Sham组仅接受等量柠檬酸盐缓冲液(0.1 mol·L-1)腹腔注射。在STZ注射后第72 h后用生化试剂盒测量血糖，72 h时尾静脉空腹血糖(FBG)水平高于16.7 mmol·L-1证明DM模型建立成功。I/R、I/R+DM、I/R+DM+Sev、I/R+DM+Sev+Mdivi-1、I/R+DM+Mdivi-1组在DM建模后(或注射柠檬酸盐缓冲液)后进行结扎建立心肌I/R模型[5]：①腹腔注射1%戊巴比妥(3 mL/kg)麻醉大鼠，通过心电图四肢导联进行监测。在第三和第四肋间隙做切口并将大鼠插管连接呼吸机(潮气量：3 mL/kg，呼吸频率：60～70 次/min)。②打开心包，然后使用6/0线结扎左前降支冠状动脉，此时心脏表面立即变为白色，并且心电图ST段抬高。保持结扎15 min，然后取出丝线进行再灌注，缝合胸腔。③手术后肌肉注射80万单位的青霉素预防感染。Sham组的大鼠在进行相同的操作但不结扎。建模24 h后，I/R+DM+Sev+Mdivi-1、I/R+DM+Mdivi-1组在结扎15 min后腹膜内注射Drp1 抑制剂 Mdivi-1共0.1 mL，总剂量为1.2 mg/kg，其余组注射等量的溶剂[6]。I/R+DM+Sev、I/R+DM+Sev+Mdivi-1组大鼠根据参考文献[7]在建立在结扎15 min后吸入Sev，Sev浓度为1%。

1.3 观察指标和检测方法

1.3.1 HE染色以及检测心肌梗死面积 大鼠断头处死，取出心脏，沿结扎线分为两半，以保留结扎线和心尖之间的区域。将组织用4%的多聚甲醛固定并用梯度醇脱水，然后包埋在石蜡中，切成厚度为4 μm的组织做成玻片标本。用Mayer’s苏木精在室温下染色10 min，然后用0.5%曙红水溶液室温下染色3 min。根据HE染色结果，使用Image Pro Plus 6.0软件计算心肌梗死面积。梗死面积 =(内膜的弧长+外膜的弧长)/(疤痕的内周+疤痕的外周)×100%。

1.3.2 ELISA检测cTnI和CK-MB水平 通过ELISA检测心肌指标肌钙蛋白I(cTnI)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)，大鼠处死后采集血液样本，离心(2000 rpm，20 min)收集上层血清。然后使用ELISA试剂盒检测cTnI和CK-MB根据制造商说明书加入抗体，然后通过酶标仪检测450 nm处的吸光度，然后根据标准曲线计算浓度。

1.3.3 TUNEL染色检测心肌细胞凋亡 利用1.3.1中固定的大鼠心脏乳头肌的石蜡切片进行实验，经过常规脱蜡、抗原修复处理，并用密封液封闭并修复，然后加入50 μL 的TUNEL溶液在37 ℃下孵育1 h，洗涤后加入100 μL的二氨基联苯胺在37 ℃下孵育30 min，在显微镜下观察样品。随机选择每个组织的四个视野进行计算，并收集平均值。凋亡指数=凋亡核数/(凋亡核数+正常细胞核数)×100%。

1.3.4 Western blot检测PI3K、AKT蛋白水平 在梗塞区获得心肌组织样本，将组织匀浆、研磨获得总蛋白，蛋白浓度通过BCA试剂盒测量。使用10%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳(PAGE)(80～120 V，90 min)分离40μg的总蛋白。在100 mV的恒定电压下与PVDF膜进行湿转移。在5%牛血清白蛋白中于室温孵育1 h，然后将1∶500稀释的anti-Drp1、anti-PI3K和anti-AKT添加到PVDF膜中，并在4 ℃下孵育过夜。洗涤后在室温下添加二抗孵育1 h。然后加入化学发光试剂进行显影。 GAPDH用作内部参考。用Image J软件分析目标条带的灰度值。

2 结果

2.1 抑制Drp1对DM大鼠I/R心肌梗死的影响 Sham组无心肌梗死，I/R+DM组梗死面积和心肌组织损伤程度显著大于I/R组(P<0.05)，I/R+DM+Sev组和I/R+DM+Mdivi-1组梗死面积和心肌组织损伤程度显著小于I/R+DM组(P<0.05)，I/R+DM+Sev+Mdivi-1组梗死面积和心肌组织损伤程度显著小于I/R+DM+Sev组和I/R+DM+Mdivi-1组(P<0.05)，见表1和图1。

表1 各组心肌梗死面积比较

图1 HE染色检测心肌损伤和梗死面积

2.2 抑制Drp1对DM大鼠I/R心肌损伤标志因子的影响 I/R组cTnI和CK-MB水平显著高于Sham组(P<0.05)，I/R+DM组cTnI和CK-MB水平显著高于I/R组(P<0.05)，I/R+DM+Sev组和I/R+DM+Mdivi-1组的cTnI和CK-MB水平显著低于I/R+DM组(P<0.05)，I/R+DM+Sev+Mdivi-1组的cTnI和CK-MB水平显著低于I/R+DM+Sev组和I/R+DM+Mdivi-1组(P<0.05)，见表2。

2.3 抑制Drp1对DM大鼠I/R心肌细胞凋亡的影响 I/R组凋亡指数显著高于Sham组(P<0.05)，I/R+DM组凋亡指数显著高于I/R组(P<0.05)，I/R+DM+Sev组和I/R+DM+Mdivi-1组凋亡指数显著低于I/R+DM组(P<0.05)，I/R+DM+Sev+Mdivi-1组凋亡指数显著低于I/R+DM+Sev组和I/R+DM+Mdivi-1组(P<0.05)，见表3、图2。

表2 各组cTnI和CK-MB水平比较

2.4 抑制Drp1对DM大鼠I/R心肌细胞中PI3K/AKT的影响 I/R组PI3K和AKT蛋白水平低于Sham组(P<0.05)，I/R+DM组PI3K和AKT蛋白水平低于I/R组(P<0.05)，I/R+DM+Sev组和I/R+DM+Mdivi-1组PI3K和AKT蛋白水平显著高于I/R+DM组(P<0.05)，I/R+DM+Sev+Mdivi-1组PI3K和AKT蛋白水平显著高于I/R+DM+Sev组和I/R+DM+Mdivi-1组(P<0.05)，见图3和表4。

表3 各组凋亡指数比较

图2 TUNEL染色检测各组心肌细胞凋亡情况

图3 TUNEL染色检测抑制Drp1对DM大鼠I/R心肌细胞中PI3K/AKT的影响

表4 各组PI3K/AKT通路蛋白水平比较

3 讨论

心脏在缺血时会损伤心肌细胞，在再灌注阶段，心肌细胞会在血流恢复时再次受到损伤，此过程被称为I/R损伤。挥发性麻醉药Sev在再灌注开始时给药能改善缺血后的心脏功能并减少损伤，这被称为麻醉后处理，Sev可以缓解心肌细胞的I/R损伤[8]。七氟醚等药物进行麻醉后处理是减轻心肌损伤的有效策略，但其确切机制尚未完全阐明。近年研究[9]发现，Sev对DM患者心肌I/R的保护作用有显著的影响。

Drp1具有促进线粒体裂变促进活性氧物质表达的作用[10]。在心肌I/R模型中，Drp1易位至线粒体，导致线粒体裂变和功能障碍，并且抑制线粒体裂变可减少I/R后的心肌损伤并改善心脏功能[11]。DM对线粒体动力学有直接影响，高血糖情况下线粒体变短且变小，并由Drp1介导线粒体快速分裂，在DM小鼠的冠状内皮细胞或心肌细胞中观察到与激活的Drp1相关的线粒体裂变增加[12]。据此，我们推测Drp1可能是将DM与I/R损伤联系起来的一种关键分子。本研究结果显示DM会加剧大鼠I/R心肌损伤诱导凋亡，而Sev后处理和Drp1抑制剂Mdivi-1均可缓解I/R心肌损伤并抑制凋亡，并且Sev联合Mdivi-1可进一步的缓解I/R心肌损伤并抑制凋亡，抑制Drp1可以进一步提高Sev后处理对DM大鼠I/R的保护作用。Zheng等[13]的研究显示抑制Drp1可以缓解I/R引起的心肌损伤，而Sev也具有一定的抑制Drp1的功能抑制凋亡。体外研究[14]显示抑制Drp1可以通过促进线粒体形态恢复，促进Sev对缺氧/复氧心肌细胞的保护作用。这提示DM大鼠I/R心肌组织中Drp1的升高可阻碍Sev对心肌保护作用，抑制Drp1可促进Sev对DM大鼠I/R心肌损伤的保护作用。

研究[15]显示DM可导致PI3K/AKT通路受损，会阻碍后处理对心肌细胞的保护作用。而Drp1可通过调节PI3K/AKT通路改变细胞中葡萄糖代谢过程[16]。本研究结果显示I/R 组的PI3K和AKT蛋白水平显著低于Sham组，I/R+DM组的PI3K和AKT蛋白水平显著低于I/R组，这与上述研究结果一致，提示PI3K/AKT通路受到抑制会加重DM大鼠的心肌I/R损伤。Drp1可以通过抑制AKT相关通路诱导细胞凋亡[17]。也有研究[18]显示七氟醚可以通过促进AKT通路缓解I/R损伤；Sev可以通过Drp1缓解抑制氧化应激并调节自噬，缓解心脏I/R并保护心肌细胞[19]。I/R+DM+Sev组和I/R+DM+Mdivi-1组PI3K和AKT蛋白水平显著高于I/R+DM组，并且I/R+DM+Sev+Mdivi-1组PI3K和AKT蛋白水平显著高于I/R+DM+Sev组和I/R+DM+Mdivi-1组，提示Sev和抑制Drp1均可以通过促进PI3K/AKT通路抑制心肌细胞凋亡，保护心肌I/R损伤。但是关于Sev、Drp1以及PI3K/AKT通路之间的作用机制仍需要进一步研究。

4 结论

抑制Drp1可以通过促进PI3K/AKT通路抑制DM大鼠心肌I/R模型的心肌细胞凋亡，从而促进Sev对DM大鼠心肌I/R损伤的保护作用。