荧光PCR 熔解曲线法在结核分枝杆菌耐药基因检测中的应用

李媛媛 苏东栋

结核病是严重危害人类健康的全球十大致死原因之一,尤其是耐药结核病的出现使结核病治疗困难重重,结核病防治任重道远。所以,高效精准的药物敏感性试验(药敏试验)和耐药监测对结核病的检测和控制十分重要［1］。BACTECMGIT960液体药敏试验(MGIT960药敏试验)是目前检测MTB 对一线抗结核药品耐药性的常用方法之一［2］。但由于MTB 生长缓慢,此方法耗时较长,约需14 d 才能报告结果,以致患者延误诊断而错过最佳治疗时机。近年来,随着检测技术的不断进步,各种各样的分子诊断技术运用于结核病的诊断和耐药性检测中,为患者提供更加快速、准确的诊断和治疗建议［3,4］。荧光PCR 探针熔解曲线法(熔解曲线法)是目前临床应用较为广泛的一种分子检测技术,其通过对某些耐药基因在熔解分析中的熔点变化的检测来判定相应基因是否发生突变［5,6］。本研究设想应用荧光定量PCR 探针熔解曲线法检测耐多药结核病患者的临床分离菌株对利福平、异烟肼、乙胺丁醇及链霉素的耐药基因突变,并分析在MTB 耐药基因检测中使用荧光PCR 熔解曲线法的应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2019 年4 月～2020 年11 月间于本院住院复治肺结核的患者为研究对象,纳入符合2017 年版结核病诊断规范中复治肺结核诊断的患者(①因结核病不合理或不规律用抗结核药物治疗≥1 个月的患者；初治失败和复发患者。②年龄≥17 岁。)作为本次研究的研究对象。获得培养阳性菌株165 株,经MPB64 快速抗原检测初筛,160 株为MTB,5 株为非MTB,最终纳入160 例(株)为本研究对象。

1.2 方法

1.2.1 标本留取 所有参加本次研究的患者全部完成心电图、凝血功能、肝肾功能等常规检查,并禁食8 h,结束后,清晨给予2%利多卡因局部吸入麻醉后经电子支气管镜行病灶部位深部痰刷检,收集患者痰标本,标本量均≥2 ml/份,刷检痰标本分离培养按照《结核病诊断实验室检验规程》进行。

1.2.2 MTB 培养及药敏方法 采用传统培养法和比例法药敏试验,MTB 分离培养,并常规行药敏试验。

1.2.3 荧光PCR 熔解曲线法 严格按照MTB 利福平、异烟肼、氟喹诺酮类、卷曲霉素、阿米卡星耐药突变试剂盒说明书操作。DNA 提取：取1.5 ml 处理后的支气管刷检样本(处理同分离培养)加入1.5 ml 离心管。以12000 r/min 离心10 min,弃上清,加入200 μl灭菌水,涡旋振荡重悬沉淀物,将沉淀重悬液加入核酸自动纯化试剂管中,在每份标本中加入40 ml 二硫苏糖醇(DTT)。将试管放入核酸自动提取仪中,选取结核提取步骤,运行仪器50 min 后,将纯化的核酸转入1.5 ml离心管中,99℃加热20 min 后14000 r/min 离心10 min,吸取5 μl 上清液,加入到含20 μl PCR 反应液的反应管中,放入ABI7500 实时荧光PCR 扩增仪进行扩增和熔解分析。PCR 反应的程序为将尿嘧啶糖苷酶(UNG)去污染处理2 min,50℃,1 次；预变性95℃,10 min,1 个循环；Touchdown 循环95℃、10 s,71℃、15 s(每个循环下降1℃),78℃、15 s,10 个循环；PCR 循环程序95℃、10 s,61℃、15 s,78℃、15 s,45 个循环。熔解分析：95℃、2 min,40℃、2 min,45～85℃(设置在此阶段每1℃采集FAM 和TET 通道荧光信号),1 个循环。

1.3 观察指标 每例患者采用同一标本进行绝对浓度法和熔解曲线法耐药基因检测,对绝对浓度法和熔解曲线法检测利福平、异烟肼耐药性结果不一致的对象以绝对浓度法为验证金标准。观察熔解曲线法对利福平、异烟肼的检测敏感度、特异度、准确度。

1.4 统计学方法 采用SPSS24.0 统计学软件处理数据。计数资料以率(%)表示,采用χ2检验；选择Kappa一致性检验检验两种方法。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

同一标本应用两种方法检测时,绝对浓度法检出利福平21 例耐药,139 例敏感；检出异烟肼68 例耐药,92 例敏感。熔解曲线法检出利福平17 例耐药,139 例敏感,4 例未检出结果；检出异烟肼61 例耐药,99 例敏感。熔解曲线法对利福平的检测准确度为96.15%、敏感度为87.50%、特异度为98.39%；对异烟腓的检测准确度为95.00%、敏感度为88.57%、特异度为96.80%。两种检验方法对利福平及异烟肼的耐药及敏感率比较,差异均无统计学意义(χ2=0.370、0.636,P=0.543、0.425＞0.05)。

表1 观察熔解曲线法检测的准确度、敏感度及特异度(n,%)

3 讨论

荧光PCR 熔解曲线法结合了聚合酶链反应和荧光探针熔解曲线分析的优点,通过对目的基因进行扩增,观察其熔解温度与对照的差值,从而判断是否有耐药基因突变［7-10］。该方法简便、快速、高效,可以准确检出耐药基因的具体突变位点,适用于专科医院进行大批量样本检测。

本研究以绝对浓度法药敏试验为标准,分别检测了利福平、异烟肼耐药情况,结果显示熔解曲线法对利福平的检测准确度为96.15%、敏感度为87.50%、特异度为98.39%；对异烟腓的检测准确度为95.00%、敏感度为88.57%、特异度为96.80%。两种检验方法对利福平及异烟肼的耐药及敏感率比较,差异均无统计学意义(P＞0.05)。表明熔解曲线法和绝对浓度法的一致性良好。研究中,熔解曲线法检出对利福平139 例敏感,17 例耐药,4 例标本未检出,原因可能RRDR 区域以外的DNA 发生突变或其他机制导致。耐药荧光PCR熔解曲线法作为快速筛查MTB耐药的分子学方法,虽然与标准的方法相比不完全一致,且检测的基因位点有限,但因其良好的敏感度和特异度,节约时间、安全高效,是临床检验及诊治耐药结核的有效手段。

荧光PCR 熔解曲线法作为快速筛查MTB 耐药的分子学方法,虽然与标准的方法相比不完全一致,且检测的基因位点有限,但因其良好的敏感度和特异度,节约时间、安全高效,是临床检验及诊治耐药结核的有效手段。