赤水河流域不同地区酱香型白酒风味化合物分析

唐 平，卢 君,*，毕荣宇，山其木格，王 丽，王 凡，李长文

（1.贵州国台酒业股份有限公司，贵州 仁怀 564501；2.天士力控股集团有限公司研究院，天津 300410）

酱香型白酒，作为中国十二大香型白酒之一，因其独特的风味、口感和相对较好的饮后舒适度，深受广大消费者的青睐[1]。酱香型白酒的风味特征在一定程度上是由其独特地理位置（如水、土壤、气候和微生物多样性）以及特殊酿造工艺和特殊原料决定的，因而也就有“离开了茅台镇就生产不出正宗酱香型茅台酒”的说法[2]。而实际上目前酱香型白酒在全国都有生产，尤其是赤水河流域分布着众多著名的酱香白酒企业，例如茅台、郎酒、习酒、国台等企业。然而，由于产地的地理环境、气候以及微生物等原因，不同地区生产的酱香型白酒的品质有一定差异，在风味化学上表现为酒中微量香气成分及其相互间的量比关系不同[3-4]。目前，对朗姆酒[5-6]、葡萄酒[7-9]、黄酒[10-11]、浓香型白酒[12-13]在地区风味差异已有研究，但是对不同地区酱香型白酒的风味特征还鲜见报道，研究不同地区的酱香型白酒特征性香气成分，对于探明不同地区的酱香型白酒产品的品质内涵具有重要意义。

本研究采用顶空固相微萃取/液液萃取-气相色谱-质谱（headspace solid phase microextraction/liquid-liquid extraction-gas chromatography-mass spectrometry，HSSPME/LLE-GC-MS）联用技术，以赤水河流域的酱香型白酒为研究对象，围绕茅台镇核心地区、习水地区、遵义地区、金沙地区以及四川地区选取不同品牌的56 个代表性的酱香型白酒，以挥发性香气成分为基础，建立不同地区酱香型白酒分类模型，进而分析不同地区酱香型白酒的香气特征及地区差异规律。以期为我国酱香型白酒产品的地区判别和溯源研究提供借鉴，促进酱香型名优白酒质量安全与原产地溯源制度的建立，为酱香型白酒的风味品质提升提供一定的理论支撑[14-15]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验酒样材料均通过市售或酒厂之间标准酒样交换的方式获得，其中茅台镇核心地区（MTCQ）26 个样品（MT-1～6、DYT-1～7、GT-1～13），习水地区（XJCQ）8 个样品（XJ-1～8），遵义地区（ZJCQ）7 个样品（ZJ-1～7），金沙地区（JSCQ）7 个样品（JS-1～7），古蔺地区（LJCQ）8 个样品（LJ-1～8），总计56 个酱香型白酒样品。

无水乙醇（色谱纯） 天津市康科德科技有限公司；乙醛、甲酸乙酯、乙酸乙酯、甲醇、2-丁醇、丁酸乙酯、正丙醇、异丁醇、戊酸乙酯、乙酸异戊酯、正丁醇、异戊醇、己酸乙酯、庚酸乙酯、乳酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸、糠醛、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、苯乙醇、庚酸、辛酸等57 种标准物质（均为色谱纯，纯度≥98.0%）天津市光复精细化工研究所；氯化钠（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

AB204-S精密电子天平 梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司；Milli-Q超纯水仪 美国Millipore公司；2 mL进样瓶、10 μL/50 μL微量进样器 美国Agilent公司；Trace 1300气相色谱仪、Trace 1300-ISQ气相色谱-质谱联用仪 美国赛默飞世尔科技公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头、固相微萃取装置、手动进样手柄 美国Supelco公司；IT-09A型恒温磁力搅拌器 上海一恒科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 白酒样品基本理化指标的分析

总酸、总酯含量的测定采用中和滴定法[16]。

1.3.2 白酒样品香气成分分析

1.3.2.1 GC法分析白酒样品香气成分

取5 mL酒样置于储备瓶中，加入50 μL内标配制液（叔戊醇、乙酸正戊酯、2-乙基丁酸）混合样，混合均匀后，分装至进样瓶。

GC条件：HP-FFAP色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；进样口温度200 ℃；分流比25∶1；载气为高纯氮气；流速1.5 mL/min；升温程序：起始温度37 ℃，保持7 min，以3.5 ℃/min升温至45 ℃，保持3 min，再以5 ℃/min升温至80 ℃，10 ℃/min升温至100 ℃，保持4 min，再以20 ℃/min升温至180 ℃，15 ℃/min升温至200 ℃，保持7 min；氢火焰离子化检测器温度250 ℃。

1.3.2.2 HS-SPME-GC-MS法分析白酒样品香气成分

HS-SPME条件：准确量取2.5 mL酒样，7.5 mL超纯水置于20 mL顶空进样瓶中，并加入50 μL 2-乙基丁酸内标溶液，2 g氯化钠，将顶空进样瓶密封，在50 ℃、300 r/min平衡10 min；将老化好的萃取头插入顶空瓶中，恒温萃取40 min后取出纤维头，插入GC进样口，解吸5 min。

GC条件：HP-FFAP色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；进样口温度200 ℃；分流比50∶1；载气为氦气；升温程序：起始温度37 ℃，保持9 min，以3 ℃/min升温至45 ℃，再以10 ℃/min升温至100 ℃，保持4 min；再以15 ℃/min升温至180 ℃，保持5 min，再以5 ℃/min升温至200 ℃，保持4.5 min，总运行时间40 min。

MS条件：电子电离源（electron ionization，EI）；电子能量70 eV；离子源温度250 ℃；传输线温度250 ℃；扫描模式为全扫描；质量扫描范围m/z30～550。

1.3.2.3 LLE-GCMS法分析白酒样品香气成分

准确吸取5 mL酒样，加入15 mL超纯水，2.0 g氯化钠，50 μL 2-乙基丁酸内标，2 mL乙醚，涡旋振荡3 min，静置30 min，吸取上层有机相1 mL至进样瓶。

GC条件：HP-FFAP色谱柱（50 m×0.25 mm，0.20 μm）；进样口温度250 ℃；不分流，载气为高纯氦气，流速1.5 mL/min；升温程序：起始温度40 ℃，保持2 min，以3.5 ℃/min升温至90 ℃，再以5 ℃/min升温至230 ℃，保持10 min，总运行时间54 min。

MS条件：EI；电子能量70 eV；离子源温度250 ℃；传输线温度250 ℃；扫描模式为全扫描；质量扫描范围m/z30～550。

1.3.3 白酒样品香气成分的定性及定量分析

1.3.3.1 定性分析

通过NIST谱库检索并结合标准品标准图谱比对确定。

1.3.3.2 定量分析

骨架物质：采用GC分析，以叔戊醇、乙酸正戊酯、2-乙基丁酸为内标物质，以待测物与相应内标物的质量浓度比为横坐标，峰面积之比为纵坐标，建立标准曲线，定量分析甲酸乙酯、乙酸乙酯、甲醇、2-丁醇、丁酸乙酯、正丙醇、异丁醇、戊酸乙酯、乙酸异戊酯、正丁醇、异戊醇、己酸乙酯、庚酸乙酯、乳酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸、糠醛、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、苯乙醇、庚酸、辛酸。

痕量物质：采用LLE-GC-MS分析，以2-乙基丁酸为内标物质，利用选择离子扫描法测定化合物的峰面积，以待测物与相应内标物的质量浓度比为横坐标，峰面积之比为纵坐标，建立标准曲线，定量分析苯甲醛、苯乙醛、异丁醛、5-甲基呋喃醛、2-戊酮、2-庚酮、2-壬酮、异丁酸、异戊酸、4-甲基戊酸、2-戊醇、庚醇、正辛醇、苯乙醇、正戊醇、正己醇、辛醇、1-壬醇、3-甲基丁酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸戊酯、戊酸丁酯、乙烯二乙酯、己酸戊酯、壬酸乙酯、3-苯丙酸乙酯、十四酸乙酯、己酸丙酯、丙酸糠酯、丁二酸二乙酯、苯乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、愈创木酚甲醚。

1.4 数据处理

所有风味化合物数据采用标准化处理，利用SIMCA-P 14软件建立偏最小二乘-判别分析（partial least squares-discriiminate analysis，PLS-DA）模型，对风味数据进行可视化趋势分析，并筛选重要风味化合物；利用R语言绘制层次聚类-热图以及相关性关联网络，表征风味化合物的潜在联系。

2 结果与分析

2.1 基本理化指标测定

白酒中的酸、酯是重要的呈香呈味物质，对白酒的品质有着十分重要的影响。据GB/T 26760—2011《酱香型白酒》[17]的要求，优质酱香型白酒的总酸含量需大于1.40 g/L，总酯质量浓度需大于2.20 g/L。研究中，对不同地区酱香型白酒样品的总酸总酯进行了检测。由表1可知，不同地区的酱香型白酒样品的总酸质量浓度均大于2.0 g/L，总酯质量浓度也均大于3.0 g/L，均远超优级标准，是品质较好的酱香型白酒。同时，显著性分析结果发现不同地区的酱香型白酒样品总酯含量无显著性差异（P＞0.05），总酸含量有显著性差异，茅台镇核心地区的总酸含量最高，古蔺地区次之，且与金沙地区存在显著性差异（P＜0.05）。

表 1 不同地区酱香型白酒样品总酸、总酯含量Table 1 Contents of total acids and total esters of Maotai-flavor liquor from different geographical origins g/L

2.2 不同地区酱香型白酒的香气成分特征分析

图 1 不同地区酱香型白酒代表性香气成分GC-MS分析总离子流色谱图Fig. 1 Total ion current chromatograms of representative aroma compounds of Maotai-flavor Baijiu samples from different producing areas

表 2 不同地区酱香型白酒中的香气成分Table 2 Relative contents of aroma compounds in Maotai-lavor Baijiu samples collected from different producing areas

续表2

续表2

通过HS-SPME与GC-MS联用对5 个地区酱香型白酒的香气成分进行检测和分析，如图1、表2所示。白酒的风味独特性与其成分密切相关，在白酒中含有数量众多组成不同的酸类、酯类和醇类等香味物质，这些物质具有不同的香气和口味，彼此相互影响，共同构成白酒风味的多样性[18-19]。研究中选取5 个地区的56 种酱香型白酒样品，利用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头结合GC-MS共检测出85 种风味物质，其中酯类化合物45 种，醇类化合物11 种，酮类化合物7 种，醛类化合物8 种，酸类化合物3 种，烷烃类化合物3 种，其他类化合物8 种。

MTCQ共检测出61 种风味物质，其中醛类化合物6 种，酯类化合物32 种，醇类化合物11 种，酮类化合物3 种，其他化合物9 种，其中酯类化合物相对含量最高，达到69.06%，其次相对含量较高的分别为醇类化合物（10.94%）、醛类化合物（3.45%）、酮类化合物（0.64%）。XJCQ共检测出63 种风味物质，其中醛类化合物5 种，酯类化合物36 种，醇类化合物11 种，酮类化合物5 种，其他化合物6 种，其中酯类化合物相对含量最高，达到77.30%，其次相对含量较高的分别为醇类化合物（8.72%）、醛类化合物（5.94%）、酮类化合物（1.07%）。ZJCQ共检测出64 种风味物质，其中醛类化合物6 种，酯类化合物36 种，醇类化合物10 种，酮类化合物6 种，其他化合物6 种，其中酯类化合物相对含量最高，达到33.49%，其次相对含量较高的分别为醇类化合物（6.65%）、醛类化合物（2.74%）、酮类化合物（1.24%）。JSCQ共检测出70 种风味物质，其中醛类化合物7 种，酯类化合物37 种，醇类化合物11 种，酮类化合物9 种，其他化合物6 种，其中酯类化合物相对含量最高，达到77.45%，其次相对含量较高的分别为醇类化合物（8.7%）、醛类化合物（6.03%）、酮类化合物（1.34%）。LJCQ共检测出63 种风味物质，其中醛类化合物5 种，酯类化合物33 种，醇类化合物10 种，酮类化合物8 种，其他化合物7 种，其中酯类化合物相对含量最高，达到77.89%，其次相对含量较高的分别为醇类化合物（8.85%）、醛类化合物（4.63%）、酮类化合物（1.31%）。

通过分析可知，不同地区的酱香型白酒的主要香气种类基本相似，体现了酱香型白酒的主要香气特性，但同一种类香气化合物及其相对含量在不同地区的差异较大。不同地区的酱香型白酒的主要风味物质为酯类化合物，其中茅台核心地区的酯类化合物种类最多。酯类化合物是白酒中重要的风味化合物，是白酒中水果、花香和甜味的主要来源，如苹果、香蕉、菠萝、玫瑰和蜂蜜，在不同香型白酒中占35%～70%[20]。其次相对含量较高的为醇类化合物，酱香型白酒中醇类化合物相对含量高，其高级醇比浓香型白酒高1 倍以上[21-22]，醇类是白酒的醇甜和助香剂的重要来源，也是酯类的前驱物质，它们可以增加酒体的甜度和醇厚感，香气特征主要是水果香和花香[23]。

2.3 不同地区酱香型白酒香气成分差异性分析

2.3.1 PLS-DA结果

图 2 不同地区酱香型白酒PLS-DA散点图Fig. 2 PLS-DA score plots discriminating Maotai-flavor liquor samples from different geographical origins

不同地区的酱香型白酒的香气成分呈现显著差异，为考察不同地区酱香型白酒样品香气成分的差异，研究中选取56 个酱香型白酒中的25 种基本骨架香气物质以及结合GC-O筛选的OAV大于1的32 种重要香气物质进行准确定量分析。利用SIMCA-P 14软件基于香气定量结果建立不同地区酱香型白酒PLS-DA分类模型，对风味化合物进行可视化趋势分析，如图2所示。通过PLS-DA模型将酱香型白酒样品明显区分为3 类。模型分类良好，且模型的解释变量和预测能力分别为0.930和0.842。遵义地区、习水地区与茅台镇核心地区的样品相互聚拢程度比较大，为一类，主要分布在第1、2象限，说明样品间差异相对较小。尽管3 个地区的酒样没有被很好地区分开，但它们也表现出各自的分布趋势。这3 个地区的酱香白酒的风味化合物分布特征相似度较大的原因可能是酒厂的地理位置上更为接近，环境条件和微生物菌群组成差异较小，均采用传统酱香白酒酿造工艺等[24]。金沙地区的酱香型白酒主要集中在第3象限，古蔺地区的酱香型白酒主要集中在第2象限，明显区分于其他地区酒样，说明样品间差异稍大，原因可能是白酒酿造属于开发式的自然发酵过程，其酿造环境的微生物区系差异所致。同时，也正是这种复杂的微生物种类，才能形成白酒中成分众多风味化合物，造就白酒不同的风格[25-27]。

PLS-DA是基于PLS法回归的一种判别方式，以预设分组变量，作为有监督的分析，弥补主成分分析方法的不足，强化组间的差异，PLS-DA变量重要性因子（variable importance in projection，VIP）可以量化PLSDA的每个变量对分类的贡献度[28]，便于筛选重要的特征物质[29]。如图3所示，VIP值越大，变量在不同产地间差异越显著[30]。

图 3 不同地区酱香型白酒PLS-DA VIP值Fig. 3 PLS-DA VIP values for differential flavor compounds in Maotai-flavor liquors from different geographical origins

为了筛选地区差异重要影响的风味物质，以VIP值大于1为指标，确定对地区区分有重要贡献的风味物质20 种，包含2-戊醇、2-丁醇、己酸、己酸乙酯、乳酸乙酯、己酸异戊酯、正丙醇、辛酸乙酯、1-戊醇、辛酸、乙酸、2-甲基丙醛、庚酸乙酯、庚酸、甲醇、苯乙醇、异戊醇、2-糠醇、戊酸丁酯、戊酸乙酯。其中2-戊醇（VIP=1.781 92）、2-丁醇（VIP=1.714 18）、己酸（VIP=1.679 92）、己酸乙酯（VIP=1.630 43），为重要的关键影响因子。2-戊醇、2-丁醇均有水果香和花香，对白酒的整体香气起到增益作用，2-丁醇的刺激性气味具有调和整体香气的能力[31]。己酸虽然具有较强的刺激性气味，但是也可以调节白酒的整体风味，具有重要的助香作用。己酸乙酯具有强烈的果香和酒香香气，对酱香型白酒的感官特征具有重要的贡献，同样是古蔺地区中含量最高的酯类物质，其含量明显高于其他地区酱香型白酒。这与Zhu Jiancai等[32]研究结果一致，其研究表明己酸乙酯是3 款郎酒产品中香气强度最高的物质，平均含量为1 692.01～2 062.5 μg/kg。推测原因可能是古蔺地区酒厂（例如郎酒厂）既生产酱香白酒，也在生产浓香白酒，因此可能在酿造环境中存在一定量的代谢产己酸乙酯的微生物，加之开放式自然发酵的工艺特点，进而导致了酱香型白酒的酒体中也含有较高含量的己酸乙酯。同时，己酸、己酸乙酯、乳酸乙酯（VIP=1.448 56）等物质是“窖底香型”调味酒的主要香气成分[33]，它是由品质好的窖池经过较长时间的发酵，取窖底酒醅蒸馏，贮存而得，所以推测其物质含量的差异也可能是由于不同酱香型白酒生产企业对窖底糟醅、窖底泥质量管理能力有差异导致。另外，地域周边环境因素和微生物菌群组成的差异也是导致不同区域酱香型白酒风味物质差异的重要原因，蔡雪梅等[33]已证实不同地域的窖泥微生物群落存在差异，而区域越相近的窖底泥的微生物群落结构越相似。本实验中区分5 个地区的酱香型白酒物质组成的关键因子包含了“窖底香型”调味酒的主要香气成分，因此，能够推测出“窖底香型”调味酒对于酱香型白酒的风味质量形成起到了至关重要的作用，未来酱香型白酒企业可以从提升“窖底香型”调味酒质量方面重点研究，进而提升产品质量和形成差异风格等。

图 4 不同地区酱香型白酒聚类及定量重要化合物热图Fig. 4 Heat map from hierarchical clustering analysis of Maotai-flavor liquors from different geographical origins

2.3.2 层次聚类分析

为了进一步探索不同地区酱香型白酒关键香气化合物的差异，采用层次聚类分析并结合热图分析，直观展示了56 种重要风味化合物在不同地区间的分布规律（3-辛醇含量较低，图中未显示）。如图4所示，颜色（由深到浅）表示相对含量由低到高的变化，颜色越深表示相对含量越多，颜色越浅相对含量越少。

酯类物质是白酒风味的重要贡献物质，其中乙酸乙酯以及己酸乙酯是相对含量较高的酯类物质，茅台核心地区的乙酸乙酯相对含量明显高于其他几个地区，而己酸乙酯相反，茅台核心地区的相对含量最低，古蔺地区以及金沙地区的相对含量相对较高。另外，值得注意的是，古蔺地区的酒样中的乳酸乙酯相对含量同样偏高于其他地区，金沙产区的相对含量较低。脂肪酸是白酒中重要的呈香物质，碳原子数小于4的脂肪酸如乙酸、丙酸、丁酸在茅台核心地区的平均相对含量明显高于古蔺地区，茅台核心地区的平均相对含量是古蔺地区的1.32 倍，而碳原子数大于5的脂肪酸如戊酸、己酸、庚酸、辛酸在古蔺产区的平均相对含量明显高于其他地区。白酒中这些短链脂肪酸主要是窖泥中梭菌的代谢产物，它们能加快乙醇在体内的代谢，降低白酒的醉度，影响肠道内微生物的生长代谢，保护肠黏膜屏障，参与宿主免疫与炎性反应，与酒精性肝脏疾病进程有密切联系，具有一定的生物活性[34]。白酒中长链脂肪酸主要是由丁酸菌和己酸菌将乙酸等代谢转化为丁酸或己酸，推测原因可能是古蔺地区与茅台镇核心产区地理环境差异较大，而导致微生物差异较大。醇类化合物主要由糖和氨基酸在酿酒酵母的作用下降解产生，酱香型白酒采用高温大曲，其蛋白质含量高，且其发酵温度也高于其他香型白酒，这些因素都会促进酒中高级醇的生成。5 个地域的醇类物质相对含量水平总体相差不大，但单体醇类物质的含量上存在一定的差异，如金沙地区的正丙醇相对含量明显高于其他地区，不同地区的2-戊醇相对含量同样也存在差异，茅台核心地区的相对含量最低，古蔺地区以及金沙地区相对含量偏高。

不同地区酱香型白酒关键香气化合物的差异造成不同地区的酱香型白酒的风格品质差异，层次聚类分析结果与PLS-DA结果一致，56 个酒样可以明显分为不同的类别，进一步验证了不同地区酱香型白酒香气存在显著差异。不同地区的56 种酱香型白酒分为3 类，DYT与GT地处茅台镇核心地区，分为一类，ZJ样品也集中于此类别中，MT与XJ分为一类。而古蔺地区与金沙地区的酒样为明显区分于其他地区的两类酒样。

3 结 论

本研究以挥发性香气成分为基础，以赤水河流域的酱香型白酒为研究对象，围绕茅台镇核心地区、习水地区、遵义地区、金沙地区以及古蔺地区选取56 个不同品牌的酱香型白酒，共检测出85 种香气成分，其中酯类化合物45 种，醇类化合物11 种，酮类化合物7 种，醛类化合物8 种，酸类化合物3 种，烷烃类化合物3 种，其他类化合物8 种，不同地区的酱香型白酒的主要香气种类基本相似，含量差异较大。以57 种重要香气化合物作为关键分类因子，建立不同地区酱香型白酒分类模型，不同地区的酱香型白酒样品呈现明显的分离趋势，以VIP及层次聚类分析结合热图分析，表征其在不同地区酱香型白酒中香气成分的分布规律。本研究可为不同地区的酱香型白酒的香气差异提供一定的理论支持。