臭氧对杏果实黑斑病的抑制及贮藏保鲜作用

李 玲，李 智，石 玲，李亚玲，何 欢，张亚琳，芦玉佳，朱 璇

（新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆 乌鲁木齐 830052）

杏（Prunus armeniacaL.）属蔷薇科杏属，是中国原产果树之一，其风味独特，深受广大消费者的喜爱[1]。据2018年数据统计，新疆杏树种植面积约为11.13万 hm2，占全疆果树种植面积的11.66%，杏果实产量为93.3万 t，是疆内果品总量的9%[2]。杏是典型的呼吸跃变型果实，在采后贮运过程中极易受到病原微生物侵染而腐烂变质，其中由链格孢菌（Alternaria alternata）引起的黑斑病是杏果实主要的采后病害，可能造成严重的采后损失[3]。目前，国内外主要通过化学药剂控制杏果实采后病害，但在实践中化学杀菌剂往往存在过量使用的情况，导致药物残留、病原菌产生耐药性和环境污染等问题[4-5]。因此，需要寻求一种安全、绿色和有效的杏果实贮藏技术。

臭氧作为一种绿色、安全的杀菌剂，2001年被美国食品药品管理局列入可直接接触食物的消毒剂[6-7]。有研究表明，臭氧对于真菌、酵母菌、沙门氏菌以及金黄色葡萄球菌等各种致病菌都具有极强的灭菌功效[8]。近年来，臭氧也被应用于果蔬贮藏保鲜[9-10]，一方面臭氧可以直接抑制病原真菌的菌丝生长与孢子萌发[11-12]；另一方面臭氧作为一种强氧化剂，可通过氧化乙烯抑制果实的呼吸作用，延缓果蔬的衰老[13]；同时臭氧作为一种诱发因子，可以诱导增强果蔬采后抗病性[14-15]。

目前，许多研究表明臭氧不仅能够降低猕猴桃的病害发生率[16-17]，提高草莓[18]和木瓜[19]的品质，还能延缓甜瓜[20]、芒果[21]的软化和成熟，但关于臭氧通过调控苯丙烷代谢与杏果实抗病性关系的相关报道较少。因此，本实验以‘赛买提’杏为材料，采用不同剂量的臭氧对接种A. alternata的杏果实进行熏蒸处理，探究杏果实抗病性与臭氧调控苯丙烷代谢的关系，为杏果实的贮藏提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料、菌株与试剂

‘赛买提’杏果实，2019年6月22日采自新疆库车县乌恰镇杏果园，选取无虫害、无损伤、色泽和大小均匀、可溶性固形物质量分数为12%～13%、硬度为（18.0±0.5）N的杏果实为实验果，当天运回新疆农业大学果品采后生理贮运研究室后，预冷24 h。

菌种A. alternata由新疆农业大学微生物实验室提供。

β-巯基乙醇、L-苯丙氨酸、几丁质、羟胺盐酸、N-乙酰葡萄糖胺、脱盐蜗牛酶、昆布多糖、肉桂酸、氧化型辅酶II、葡萄糖-6-磷酸钠、p-香豆酸、ATP、辅酶A等均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

SKY2000系列气体检测报警仪深圳市元特科技有限公司；HY-004S-4A臭氧发生器广州佳环电器科技有限公司；3H16RI智能高速冷冻离心机湖南赫西仪器有限公司；手提式压力蒸汽灭菌锅北京市永光明医疗仪器有限公司；UV-1700型紫外-可见分光光度计上海美析仪器有限公司；SW-CJ-1W洁净工作台上海博迅实业有限公司医疗设备厂。

1.3 方法

1.3.1 损伤接种

参照石玲等[22]的方法并稍作修改。取在马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基培养7 d的A. alternata，加入20 mL含0.05%（体积分数，后同）Tween-80的无菌水，用无菌药匙刮下PDA培养基上的孢子，转移到50 mL三角瓶内，摇晃混匀后用纱布滤除大块絮状物，用0.05% Tween-80溶液将孢子悬浮液浓度调节至1×106个/mL。用无菌水和75%乙醇溶液先后擦拭果实表面，晾干后用灭菌铁钉在果实赤道部位刺1 个直径为2.5 mm、深度为4 mm的孔，向孔内注入15 μL的孢子悬浮液，将接种的一面竖直向上放置，接种后的杏果实进行臭氧处理。

1.3.2 原料处理与分组

臭氧处理在预实验的基础上参照刘路[23]的方法进行。将200 mg/m3的臭氧气体充入体积为70 L的密封箱中，下通气口进气，上通气口用臭氧浓度检测仪检测，充气到达指定浓度并稳定后，密闭熏蒸30 min，采用间歇熏蒸方法，每7 d处理一次杏果实。以密封箱不通入臭氧气体的杏果实为对照组，密闭放置30 min，每个处理3 组平行，每组处理3 kg杏果实。熏蒸后置于冷库（1～2 ℃、相对湿度90%～95%）中贮藏。

1.3.3 指标测定

1.3.3.1 病斑直径及接种发病率的测定

以单个杏果实病斑直径达4 mm以上计为发病果实，用十字交叉法测定贮藏期杏果实的病斑直径，发病率按下式计算。

1.3.3.2 苯丙氨酸解氨酶、肉桂酸-4-羟化酶、4-香豆酸辅酶A连接酶活力的测定

苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL）活力的测定：参考曹建康等[24]的方法，以每克鲜果每小时在290 nm波长处吸光度变化0.01为1 个PAL活力单位（U）。

肉桂酸-4-羟化酶（cinnamic acid-4-hydroxylase，C4H）、4-香豆酸辅酶A连接酶（4-coumaric acid CoA ligase，4CL）活力的测定参考范存斐等[25]的方法，以每克鲜果每小时在340 nm波长处吸光度变化0.01为1 个C4H活力单位（U），以每克鲜果每小时在333 nm波长处吸光度变化0.01为1 个4CL活力单位（U）。

以上酶活力单位均为U/（h·g）。

1.3.3.3β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶活力的测定

β-1,3-葡聚糖酶（β-1,3-glucanase，GLU）、几丁质酶（chitinase，CHT）活力测定参照曹建康等[24]的方法。以每秒钟每克鲜果中酶分解昆布多糖产生1×10-4mol葡萄糖为一个β-1,3-葡聚糖酶活力单位，以每秒钟每克鲜果中酶分解胶状几丁质产生1×10-4molN-乙酰葡萄糖胺为一个几丁质酶活力单位。Glu、CHT活力单位均为10-4mol/（s·g）。

1.3.3.4 总酚和类黄酮含量的测定

总酚和类黄酮含量的测定参照曹建康等[24]的方法。以每克鲜果在波长280 nm处光密度值表示总酚含量；以每克鲜果在波长325 nm处光密度值表示类黄酮物质含量。

1.4 数据处理分析

利用SPSS 22.0软件对数据进行方差分析，采用Duncan检验进行差异显著性分析，P＜0.05表示差异显著，使用Origin 8.5软件作图。

2 结果与分析

2.1 臭氧处理对接种A. alternata杏果实病斑直径和接种发病率的影响

图 1 臭氧处理对损伤接种A. alternata杏果实病斑直径（A）和发病率（B）的影响Fig. 1 Effect of ozone treatment on lesion diameter (A) and the incidence of black spot disease (B) in apricot fruit inoculated with A. alternata

如图1A所示，杏果实损伤接种A. alternata后，杏果实病斑直径在整个贮藏期间呈现不断上升的趋势，但臭氧处理组的杏果实病斑直径始终低于对照组，且在贮藏21 d后，两组间杏果实的病斑直径呈现出显著差异（P＜0.05）。如图1B所示，杏果实接种发病率随着贮藏时间的延长而呈现逐渐上升趋势，在贮藏第7天时，臭氧处理组损伤接种的杏果实无发病现象，而对照组损伤接种的杏果实已经发病。贮藏结束时，臭氧处理的果实接种发病率比对照低14.07%（P＜0.05）。说明臭氧处理可明显抑制杏果实病斑直径的扩大和降低杏果实接种发病率。

2.2 臭氧处理对杏果实贮藏过程中PAL活力的影响

图 2 臭氧处理对杏果实贮藏过程中PAL活力的影响Fig. 2 Effect of ozone treatment on PAL activity in apricot fruit

PAL作为苯丙烷代谢中的关键酶，与植物的抗病性关系密切[26]。从图2可知，臭氧处理组和对照组的杏果实PAL活力都是呈先上升后下降趋势，但在整个贮藏期内，臭氧处理组的杏果实PAL活力显著高于对照组的。在贮藏14 d时，臭氧处理组和对照组的PAL活力都达到峰值，其中臭氧处理组PAL活力是对照组的1.53 倍（P＜0.05）。贮藏结束时，臭氧处理组PAL活力是对照组的4.94 倍（P＜0.05），表明臭氧可以有效减缓杏果实的PAL活力降低，提高杏果实抗病性。

2.3 臭氧处理对杏果实贮藏过程中C4H活力的影响

图 3 臭氧处理对杏果实贮藏过程中C4H活力的影响Fig. 3 Effect of ozone treatment on C4H activity in apricot fruit

由图3可发现，在贮藏的0～28 d，臭氧处理组和对照组的杏果实C4H活力均呈上升趋势，无明显差异。但在贮藏28 d后，对照组的C4H活力逐渐下降，臭氧处理组的C4H活力仍继续上升，且在贮藏42 d达到峰值，与对照组相比差异显著。在贮藏结束时，臭氧处理组C4H活力是对照组的1.16 倍（P＜0.05）。

2.4 臭氧处理对杏果实贮藏过程中4CL活力的影响

如图4所示，在贮藏期间，对照组的杏果实4CL活力呈缓慢下降趋势，而臭氧处理组的4CL活力总体呈现先上升后下降的趋势，臭氧处理杏果实的4CL活力始终显著高于对照杏果实。贮藏第35天时，臭氧处理组的4CL活力达到峰值，是此时对照组的1.62 倍（P＜0.05）。在贮藏35 d后，臭氧处理组杏果实的4CL活力下降，但始终显著高于对照组（P＜0.05）。

图 4 臭氧处理对杏果实贮藏过程中4CL活力的影响Fig. 4 Effect of ozone treatment on 4CL activity in apricot fruit

2.5 臭氧处理对杏果实贮藏过程中GLU活力的影响

图 5 臭氧处理对杏果实贮藏过程中GLU活力的影响Fig. 5 Effect of ozone treatment on GLU activity in apricot fruit

GLU是重要的病程蛋白，对病原菌有直接的杀菌作用[27]。由图5可知，对照组和臭氧处理组的杏果实GLU活力整体上均先升高后下降，但在贮藏期间，臭氧处理组的GLU活力显著高于对照组。在贮藏21 d时，对照组的GLU活力达到峰值，而臭氧处理组在第7天就达峰值，一直维持到21 d后才开始下降，在第21天时，臭氧处理组的GLU活力是对照组的1.66 倍（P＜0.05）。在贮藏21 d后，对照组和臭氧处理组的杏果实GLU活力均呈下降趋势，但臭氧处理组的GLU活力始终显著高于对照组，说明臭氧处理可以延缓杏果实GLU活力下降，增强杏果实对病害的抵御能力。

2.6 臭氧处理对杏果实贮藏过程中CHT活力的影响

图 6 臭氧处理对杏果实贮藏过程中CHT活力的影响Fig. 6 Effect of ozone treatment on CHT activity in apricot fruit

如图6所示，处理组和对照组的杏果实贮藏过程中CHT活力均呈先上升后下降的趋势。在贮藏42 d时，臭氧处理组和对照的贮藏过程中CHT活力均达到峰值，其中臭氧处理组的贮藏过程中CHT活力是对照组的1.58 倍（P＜0.05）。在第49天时，两组贮藏过程中CHT活力都下降，其中臭氧处理组的贮藏过程中CHT活力显著是对照组的1.73 倍（P＜0.05）。

2.7 臭氧处理对杏果实贮藏过程中总酚和类黄酮含量的影响

图 7 臭氧处理对杏果实贮藏过程中总酚（A）和类黄酮（B）含量的影响Fig. 7 Effect of ozone treatment on total phenolic (A) and flavonoid (B)contents in apricot fruit

由图7A可知，在贮藏期间，臭氧处理组和对照组的总酚含量均呈先上升后下降趋势，臭氧处理组的杏果实总酚含量比对照组高。在贮藏35 d时，对照组出现峰值，而臭氧处理组在贮藏42 d时出现峰值。贮藏结束时，臭氧处理组总酚含量比对照组高8.9%（P＜0.05）。

如图7B所示，在贮藏期间，臭氧处理组的杏果实类黄酮含量呈现上升趋势，对照组果实的类黄酮含量呈波动上升趋势，但臭氧处理组的杏果实类黄酮含量整体上显著高于对照组。在贮藏21 d时，臭氧处理组的杏果实类黄酮比对照组高12.20%（P＜0.05）。贮藏第49天，臭氧处理组的类黄酮含量是对照组的1.15 倍（P＜0.05）。

3 讨 论

已有的研究结果表明，适宜浓度的臭氧处理可以有效抑制果蔬采后病害的发生[13]。本实验结果表明，200 mg/m3臭氧处理能有效抑制杏果实病斑直径的扩展，显著降低杏果实损伤接种发病率。郭宇欢等[28]研究发现90 μL/L臭氧处理葡萄15 min，可明显降低‘红地球’葡萄灰霉病的发病率。臭氧处理能够抑制果蔬采后病害的发病，一方面是因为臭氧处理可以直接抑制病原真菌的菌丝生长和孢子萌发。Luo Anwei等[17]对猕猴桃的研究指出，适宜浓度的臭氧处理能够有效抑制灰葡萄孢（Botrytis cinerea）和扩展青霉（Penicillium expansum）的菌丝生长和孢子萌发。García-Martín等[29]对柑橘的研究表明，1.6 mg/kg臭氧处理可以显著抑制指状青霉（Penicillium digitatum）和意大利青霉（Penicillium italicum）的菌丝生长。另一方面，臭氧增强果蔬的抗病性可能与调控抗病相关代谢途径有关[13,30]。苯丙烷代谢途径是果蔬抗病反应中的关键代谢途径，PAL、C4H和4CL是催化苯丙烷代谢的关键酶。其中PAL作为苯丙烷代谢中的关键酶和限速酶，能够促进合成抗菌物质如酚类、植保素等，植物的抗病性与这些物质密切相关[26]。C4H作为继PAL之后苯丙烷代谢的又一关键酶，参与生成p-香豆酸，C4H活力的增强可促进酚酸类物质的合成，抑制病原菌的生长和繁殖[31]。4CL控制苯丙烷代谢主途径向分支途径的转折[32]。本实验结果表明，200 mg/m3臭氧处理显著提高了杏果实PAL、C4H和4CL的活力。苏苗[33]研究表明，臭氧降低猕猴桃病害的发生与PAL活力的增加相关。水杨酸和24-表油菜素内酯处理杏果实的研究也表明，其可以通过诱导杏果实PAL、C4H和4CL活力的升高，增强杏果实采后的抗病性[34-35]。说明臭氧处理增强杏果实抗病性与苯丙烷代谢的调控密切相关。

GLU和CHT是果蔬中的病程相关蛋白[36]，可以使真菌细胞壁受到损坏，抑制真菌的生长繁殖和提高植物的抗病害能力[27,37]。Luo Anwei等[17]研究表明，适宜剂量的臭氧处理增强猕猴桃的抗病性与GLU和CHT活力的提高密切相关。郭宇欢[38]对葡萄的研究发现，90 μL/L臭氧处理可以通过提高葡萄中GLU和CHT的活力，降低灰霉菌对葡萄的侵染。本实验研究发现，200 mg/m3臭氧处理显著提高杏果实GLU和CHT的活力，增强杏果实的抗病性，与上述研究结果相同。

总酚和类黄酮是苯丙烷类代谢途径的最终产物。酚类物质自身具有抗病害能力，可抑制病原微生物的繁殖，同时又参与合成木质素，类黄酮则是重要的植保素，其含量反映了植物的抗病性[39]。本实验结果表明，200 mg/m3臭氧处理有利于类黄酮和总酚的积累。Chen Cunkun等[40]指出，适宜浓度的臭氧处理可有效促进草莓总酚和类黄酮含量的积累，有助于提高草莓抗病性。Yeoh等[41]对鲜切木瓜的研究发现，9.2 μL/L臭氧处理20 min，臭氧处理组总酚含量的积累与鲜切木瓜抗病性的提高相关。综上，总酚和类黄酮含量的积累是增强杏果实抗病性的重要因素之一。

本实验表明，200 mg/m3臭氧处理能够有效抑制病斑直径的扩展和显著降低杏果实的接种发病率，提高了杏果实的PAL、C4H、4CL、GLU和CHT活力及总酚和类黄酮的含量，表明臭氧可通过调控杏果实体内的苯丙烷代谢相关酶的活力，增强杏果实的抗病性。目前，臭氧作为一种低成本且绿色的采后处理，其应用前景广泛，关于臭氧在果蔬采后领域的应用也越来越多，但臭氧的贮藏保鲜效果与贮藏的温度、果蔬的品种、臭氧处理的剂量等多种因素有关，而且在实际操作过程中需要提高处理技术的安全性，因此，臭氧在大规模引用于商业贮藏前，很多工作还需完善。