基于“成分-靶点-通路”网络和分子对接技术的泻火消瘿方治疗格雷夫斯病药效物质基础和作用机制初探

崔国倩，项艳，曲晓洋，相萍萍，朱粉霞，谢亚萍

(南京中医药大学附属中西医结合医院，江苏省中医药研究院国家中医药管理局中药口服释药系统重点实验室，江苏 南京 210028)

格雷夫斯病(Graves diseases，GD)，亦称弥漫性毒性甲状腺肿，是一种体内甲状腺激素分泌增多的自身免疫性代谢疾病[1]，以弥漫性甲状腺肿和分泌功能亢进为主要特征，为甲状腺功能亢进症(简称甲亢)最常见的类型，约占甲亢的85%[2]。近年来，该病呈患病率逐年增多和起病年轻化的趋势[3-5]，还与许多潜在的致命疾病如心脏衰竭、心肌梗死、中风等密切相关，甚至会增加自杀及全因死亡风险[6-8]。

中医根据GD的临床症状，可将其归属于“瘿气”和“瘿病”的范畴。关于GD的发病病机，虽各方医家持有不同观点，但多认为肝郁及阴虚为其主要病因[9]。临床表现主要以脏腑气血功能失调、肝气郁结、经脉气机阻遏，内郁日久而生痰化火、耗损阴津，最终痰气郁结交互阻于颈项而发瘿瘤[2]。

GD的临床治疗主要包括抗甲状腺药物(Antithyroid drugs，ATDs)、放射性治疗和手术治疗，但普遍存在缓解率低、复发率高、长期疗效不理想、并发症多等问题[10]。为此，寻求更有效的治疗方法和药物迫在眉睫。

泻火消瘿方是江苏省中西医结合医院应用多年的临床协定经验方，其组成为龙胆、夏枯草、黄芩、生地黄、百合、知母及穿山龙[11]，是在龙胆泻肝汤的基础上化裁凝练而成，具有清肝泻火、滋阴宁心的功效。在前期临床研究中发现泻火消瘿方有助于GD患者甲状腺功能迅速恢复，提高疾病恢复率，减少ATDs的应用[12]，但其治疗GD的药效物质基础和具体机制并不清楚，有待进一步阐明。

本研究基于网络药理学和分子对接技术，通过网络药理学筛选、预测和查找泻火消瘿方的活性化学成分和作用靶点，构建“药材-成分-靶点”网络、靶点蛋白相互作用(PPI)、靶点功能通路等多层次生物信息网络，进而用分子对接进行验证，揭示泻火消瘿方治疗GD的药效物质基础和作用机制，为临床应用提供理论依据(图1)。

图1 研究思路

1 材料与方法

1.1 泻火消瘿方中化学成分的收集

借助TCMSP数据库(http://tcmspw.com)和CNKI数据库(https://www.cnki.net/)，收集泻火消瘿方中龙胆草、夏枯草、黄芩、生地黄、百合、知母、穿山龙7味药材的化学成分。以口服吸收利用度(Oral bioavailability，OB)≥20%，药物相似性(Drug likeness，DL)≥0.18作为参数进行筛选，获取泻火消瘿方的化学成分数据集。进而通过PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)获得每个化合物的2D结构集；再使用Chem3D 19.0将其转化成mol2文件。利用Discovery Studio(DS)2016软件对泻火消瘿方中化学成分的3D结构进行预处理，从而生成泻火消瘿方中化学成分的3D结构数据库。

1.2 泻火消瘿方化学成分治疗GD的潜在作用靶点筛选

基于Swiss Target Prediction数据库(www.swisstargetprediction.ch/)，以Probability值>0.5为参数筛选靶点，同时结合DrugBank数据库(https://www.drugbank.ca/)和PharmMapper数据库(http://www.lilab-ecust.cn)提供的靶点信息，反向预测泻火消瘿方中化学成分所作用的潜在靶点。将各个数据库的预测结果取并集，并删除重复结果，最终获得泻火消瘿方中化学成分的作用靶点集。

以“Graves diseases”为关键词，在TTD(http://bidd.nus.edu.sg/)、DisGeNET(http://www.disgenet.org/)和GeneCards(https://www.genecards.org/)数据库中搜索获得GD疾病相关靶点集。

将以上筛选出的泻火消瘿方化学成分作用靶点集，与寻获的GD相关疾病靶点集取交集，即获得泻火消瘿方化学成分治疗GD的潜在作用靶点集。通过UniProt数据库将交集靶点规范为人源(Homo Sapiens)的标准基因，作为靶点标准化名称。

1.3 “药材-成分-靶点”网络、PPI网络的构建

标识以上靶点集对应属性，导入Cytoscape3.6.1构建泻火消瘿方“药材-成分-靶点”网络。再将泻火消瘿方中化学成分的靶点蛋白导入STRING数据库(https://string-db.org/)，物种选择“Homo Sapiens”，构建PPI网络。

1.4 靶点通路注释分析

为进一步分析泻火消瘿方化学成分治疗GD的潜在作用靶点集的基因功能以及在信号通路中的作用，将其官方简称上传到Matescape数据库(http://metascape.org/)，设定阈值P<0.01，同时Background选择“Homo Spanies”，经上述数据库检索和转化操作，分别进行蛋白的GO富集分析和KEGG代谢通路富集分析，并对富集分析结果进行可视化处理[13]。

1.5 关键靶点分子对接验证

利用DS 2016软件构建关键靶点的分子对接模型，进而与泻火消瘿方中筛选出的主要活性化合物，进行分子对接，分析对接结果。并与GD阳性药分子比较，验证网络分析结果的可靠性。首先在PDB数据库下载泻火消瘿方活性化学成分治疗GD关键靶点的蛋白晶体结构，选择人源受体、解析度小于2.5 Å并具有配体的蛋白复合物，以保证对接的精度。采用DS 2016中CleanProtein工具对蛋白进行预处理，根据PDB晶体原配体的空间位置定义活性口袋，Conformation method参数设置为“Best”，Docking preferences参数设置为“High quality”，其余参数为默认。将原配体抽出后重新对接到蛋白的活性口袋中，根据对接后的配体分子与原配体分子的均方根偏差(RMSD)大小判断对接程序参数设置的合理性以及对该晶体复合物的实用性，一般认为当RMSD≤2 Å时说明分子对接模型能够较好地重现原配体与蛋白的结合模式，对接结果有较高的可靠性[14]。再将泻火消瘿方中潜在活性成分及抗GD阳性药分子导入DS 2016中进行分子对接，计算对接打分值(-CDOCKER ENERGY)。

当-CDOCKER ENERGY值高于原配体时，可认为成分与靶点具有较高的结合活性，以此作为标准对分子对接结果进行评价，并与阳性药分子的-CDOCKER ENERGY值对比。

2 结果

2.1 化合物及靶蛋白筛选结果

通过TCMSP数据库共检索到多个化合物(符合条件OB≥20%，DL≥0.18)，其中龙胆含有17个成分，夏枯草含有16个成分，黄芩含有36个成分，百合含有9个成分，知母含有15个成分以及穿山龙含有4个成分成分。对于生地黄，通过TCMSP数据库不能检索到其化合物，我们通过查阅文献，得到生地黄中的化学成分[15-17]，进而在TCMSP网站中查看其OB值和DL值，最终有7个化学成分符合条件，因此，选择这7个化合物作为生地黄的主要成分。知母中的芒果苷和知母皂苷BⅡ是2020年版《中国药典》中规定的指标性成分，但是在TCMSP网站中未检索到芒果苷的OB值和DL值，检索到知母皂苷BⅡ的OB值和DL值分别为3.11和0.04，因其比较重要，亦将其添加上[18]。去掉7个重复成分(齐墩果酸、异荭草素、β-谷甾醇、山柰酚、西托糖苷、植物甾醇和豆甾醇葡萄糖苷)。因此，共确定泻火消瘿方化学成分92个。

收集到的化学成分较多，因此对其进行一个分类分析。图2的圆环图表明，泻火消瘿方中化学成分主要集中在黄酮类，其次分别是萜类、甾体和生物碱等。

图2 泻火消瘿方中化学成分的主要结构类型

2.2 泻火消瘿方化学成分治疗GD潜在作用靶点筛选结果

在DrugBank、PharmMapper及Swiss Target Prediction数据库上传92个化学成分结构信息，获取其作用靶点，将3个数据库获得的人源靶点进行汇总并去除重复靶点，最终获得与泻火消瘿方化学成分相关的人源靶点1 154个。

以“Graves diseases”为关键词，利用TTD、GeneCards和OMIM数据库对靶点进行检索，去重以后共获得GD相关靶点1 467个。

将泻火消瘿方中化学成分作用的1 154个潜在作用靶点映射到1 467个GD靶点集中，最终获得泻火消瘿方治疗GD的潜在作用靶点为227个(图3)。其中君药龙胆化学成分共占154个靶点，臣药夏枯草和黄芩分别占121、160个靶点，佐药生地黄、百合、知母和穿山龙分别占71、114、149、68个靶点。

图3 泻火消瘿方反向找靶及治疗GD潜在作用靶点研究

2.3 构建“药材-成分-靶点”网络图

借用Cytoscape构建网络图，可以直观显示7味中药成分和靶点的关系及其重要性。如图4所示，图中共有326个节点，2 924条网络。度值(Degree)是指连接该节点的边的数量，连接该点的边越多，度值越大，说明与该点相关的网络越复杂[13]。在软件中设置节点大小与颜色反映Degree的变化，节点越大、颜色越深，则Degree越大，从而构建泻火消瘿方对GD的潜在治疗靶点网络。

从图4可看出，成分中Degree最大的是植物甾醇(E1，Degree=132)，其次是西托糖苷(D1，Degree=120)、β-谷甾醇(B1，Degree=107)、豆甾醇葡萄糖苷(F1，Degree=80)、山柰酚(C1，Degree=72)、齐墩果酸(A1，Degree=68)和异荭草素(A2，Degree=65)，均为重复成分。以Degree为依据进行靶点排序，前15位靶点分别为CA2、CA1、ESR2、MET、EGFR、SRC、FLT3、PTGS2、ESR1、ABCB1、IGF1R、MMP9、MMP3、PIK3CG、NOX4。

图4 泻火消瘿方“药材-成分-靶点”网络图

2.4 构建PPI网络

将筛选出的227个靶点导入STRING平台构建PPI表。利用Cytoscape进行PPI网络分析，同时利用Cytoscape模块分析功能进行聚类分析，从而得到最佳模块。如图5所示，将最佳功能模块分为模块一(MCODE-1)、模块二(MCODE-2)、模块三(MCODE-3)、模块四(MCODE-4)、模块五(MCODE-5)、模块六(MCODE-6)。

图5 泻火消瘿方干预GD的PPI网络图

网络中PPI靶点有227个，2 935条边代表了蛋白之间相互作用关系。通过10种计算方法(MCC、Degree、MNC、EPC、BottleNeck、EcCentricity、Closeness、Radiality、Betweenness、Stress)，选出各方法计算出的前50位靶点，并取其交集，分别是EGFR、SRC、JUN、HSP90AA1、TP53、HSPA1A、MAPK3、GRB2、STAT3、ESR1、MAPK14、PIK3R1、CTNNB1、HPSAS、HDAC1、PARP1、HDAC2、CCND1，推测以上18个靶点可能是泻火消瘿方治疗GD的关键靶点。

2.5 模块化分析

再将获得的227个泻火消瘿方治疗GD的潜在作用靶点导入到Metascape数据库，应用分子复合物检测(MCODE)算法来识别PPI网络，按照P值将PPI网络划分得到最佳功能模块，具体结果如图6。

图6 PPI模块分析

其中MCODE-1为图7中的红色节点，主要参与癌症通路(Pathways in cancer)、Rap1信号通路(Rap1 signaling pathway)；MCODE-2为图7中的蓝色节点，主要参与癌症通路(Pathways in cancer)、癌症中蛋白聚糖(Proteoglycans in cancer)；MCODE-3为图7中绿色节点，主要参与神经活性配体-受体相互作用(Neuroactive ligand-receptor interaction)；MCODE-4为图7中紫色节点，主要参与甲型流感(Influenza A)；MCODE-5为图7中橙色节点，主要参与胰岛素抵抗(Insulin resistance)、mTOR信号通路(mTOR signaling pathway)；MCODE-6为图7中黄色节点，主要参与TNF信号通路(TNF signaling pathway)。

图7 PPI网络

2.6 靶蛋白生物分析结果

通过Metascape数据库对泻火消瘿方与GD交集靶点进行KEGG富集分析和GO富集分析，获得靶基因参与的通路和生物过程。结果显示，通过对成分靶蛋白进行生物分析,共得到KEGG通路192条(P<0.05)，根据通路P值，结合生物学信息，选取P值相对较小且靶点富集的20条生物学过程。

以KEGG数据库中富集得到的通路信息绘制KEGG通路气泡图，结果见图8。发现癌症通路(Pathways in cancer)、弓形虫病(Toxoplasmosis)、糖尿病并发症AGE-RAGE信号通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、癌症中心碳代谢(Central carbon metabolism in cancer)、神经活性配体-受体相互作用(Neuroactive ligand-receptor interaction)、TNF信号通路(TNF signaling pathway)、cAMP信号通路(cAMP signaling pathway)、肌动蛋白细胞骨架调节(Regulation of actin cytoskeleton)、利什曼病(Leishmaniasis)、人T细胞白血病病毒1感染(Human T-cell leukemia virus 1 infection)等生物学过程，在泻火消瘿方治疗GD中发挥重要作用。

图8 KEGG富集分析气泡图

将KEGG富集结果与泻火消瘿方“药材-成分-靶点”网络图进行结合，构建“成分-靶点-通路”网络，结果如图9所示，其中粉紫色正方形代表信号通路，大小代表-logP值。

图9 泻火消瘿方成分-靶点-通路网络图

GO功能富集分析得到GO条目2 385个(P<0.05)，其中生物过程(BP)条目1 988个，细胞组成(CC)条目255个，分子功能(MF)条目142个，选取P值相对较小且靶点富集的20条BP条目绘制GO条目柱状图，如图10所示。BP富集到的条目主要为细胞迁移正向调控(Positive regulation of cell migration)、对外部刺激反应的正向调节(Positive regulation of cell migration)、对有机环状化合物的细胞应答(Cellular response to organic cyclic compound)、MAPK级联反应的调控(Regulation of MAPK cascade)、对氮化合物的细胞应答(Cellular response to nitrogen compound)、白细胞与细胞黏附(Leukocyte cell-cell adhesion)、循环系统进程(Circulatory system process)等；CC主要富集到膜筏(Membrane raft)、膜面(Side of membrane)、细胞的顶端部分(Apical part of cell)、受体复合体(Receptor complex)、囊泡腔(Vesicle lumen)、溶泡(Lytic vacuole)、黑素体(Melanosome)等；MF主要富集到激酶结合(Kinase binding)、蛋白激酶活性(Protein kinase activity)、核受体活性(Nuclear receptor activity)、趋化因子结合(Chemokine binding)、蛋白质结构域特异性结合(Protein domain specific binding)、蛋白质酪氨酸激酶活性(Protein tyrosine kinase activity)、脂质结合(Lipid binding)等。

图10 GO分析结果

2.7 关联性分析

将Metascape数据库与DisGeNET数据库进行连接，采用文本挖掘技术对疾病、复杂疾病和环境性疾病进行了相关性分析。基因组中的所有基因均已用作富集背景，收集P<0.01，最小计数为3和富集因子>1.5(富集因子是观察到的计数与偶然预期的计数之间的比率)的术语，并根据其成员相似度将其分组。

结果如图11所示，从图中可看出上述筛出的泻火消瘿方的227个靶点与GD具有紧密的关联性，GD排在首位，之后依次为腹主动脉瘤(Aortic aneurysm，abdominal)、心肌缺血(Myocardial ischemia)、实验性糖尿病(Diabetes mellitus，experimental)、肺部疾病(Lung diseases)、糖尿病视网膜病变(Diabetic retinopathy)等。此可证明筛出的227个靶点与其他疾病靶点具有重合靶点，可推测GD与其他疾病具有并发关系。GD病症常伴有心血管功能紊乱、呼吸功能异常、肝功能损害等表现，特殊情况主要包括Graves眼病、甲亢性心脏病以及周期性麻痹等[2]，以上现象均可证明GD与计算出的各个疾病具有紧密关联。

图11 泻火消瘿方与疾病的关联分析

进一步从发育、分化等方面探索227个靶点与各个细胞、组织的关联性，从图12中可发现泻火消瘿方与HEPG2、HUVEC、DRG、心肌细胞等特异性细胞和肺、脾脏、骨髓、肾脏、肝脏等特异性组织，均具有紧密联系。这与上文阐述的GD病变涉及五脏形成对应，证明了泻火消瘿方对GD的治疗作用。

图12 泻火消瘿方与细胞、组织的关联分析

2.8 分子对接结果

为验证本研究网络分析结果的准确性，以“药材-成分-靶点”网络的Degree为依据进行化学成分排序，选取前29位化学成分；将泻火消瘿方“药材-成分-靶点”网络图筛选出的关键靶点与泻火消瘿方干预GD的PPI网络图计算出的关键靶点相结合，对这些靶点进行搜索，最终有14个关键靶点的配体与受体可用，所以选取这14个靶点作为分子对接的关键靶点，分别为SRC、JUN、HSP90AA1、ESR1、HSPA1A、MAPK14、PIK3R1、PARP1、ESR2、IGF1R、PIK3CG、TOP2A、F2及MET；将化学成分与关键靶点建立分子对接模型，将原配体从活性口袋中抽离并重新对接，计算对接后的RMSD及-CDOCKER ENERGY值。

结果显示,SRC、JUN、HSP90AA1、ESR1、HSPA1A、MAPK14、PIK3R1、PARP1、ESR2、IGF1R、PIK3CG、TOP2A、F2、MET分子对接模型RMSD值分别为0.775 9、0.568 4、0.562 4、0.856 8、0.776 2、0.512 0、0.641 0、1.210 2、0.624 4、0.660 4、0.524 6、0.727 8、0.669 1、1.070 5 Å，均小于2 Å，认为能够较好地重现原配体与蛋白的结合模式，对接结果具有较高可靠性，靶点具体信息见表1，靶点对接模型见图13。

表1 靶点信息

图13 靶点对接模型

将上述14个靶点与29个潜在活性成分及3个治疗GD的阳性药成分甲亢平(Y1)、丙硫氧嘧啶(Y2)、甲硫咪唑(Y3)，进行对接，对接结果如表2所示。各靶点与阳性药分子对接结果显示，泻火消瘿方中部分潜在活性成分与靶点-CDOCKER ENERGY值大于Y1、Y2、Y3与靶点结合的-CDOCKER ENERGY值，表明泻火消瘿方的活性化学成分作用强于阳性药。结合上述结果，泻火消瘿方中的成分与潜在关键靶点具有较好的结合活性，提示泻火消瘿方中药材可能通过作用于潜在关键靶点产生抗GD的作用。

表2 对接结果

3 讨论

3.1 泻火消瘿方治疗GD潜在有效成分、关键靶点及可能作用机制

通过TCMSP数据库和文献调研，基于已定化合物的OB和DL值，得出92个成分，重复成分有7个。筛选出泻火消瘿方治疗GD的潜在作用靶点为227个。将以上收集的成分与靶点构建泻火消瘿方“药材-成分-靶点”网络。本研究中，以Degree网络特征为依据并进行分析，得出泻火消瘿方治疗GD潜在有效成分排序表，进而以Degree值中位数的2倍(Degree=30)为界限，筛选出泻火消瘿方治疗GD潜在有效成分29个和潜在靶点14个。

本研究由网络分析获得的29个泻火消瘿方治疗GD的潜在有效成分，包括植物甾醇、西托糖苷、β-谷甾醇、豆甾醇葡萄糖苷、山柰酚、齐墩果酸、异荭草素、薯蓣皂苷和迷迭香酸等成分。文献报道异荭草素可通过干扰癌细胞增殖、诱导癌细胞凋亡、调控活性氧水平等多种途径实现抗癌目的[19]，熊果酸可有效抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡及影响肿瘤组织的血管生成[20]，以上作用与KEGG富集得到的通路信息癌症通路(Pathways in cancer)结果一致；在对红景天苷的研究中得知其可通过调控Nrf2的表达逆转由AGE引起的HK-2细胞凋亡以及糖尿病导致的肾脏组织损伤[21]，这一作用与通路信息糖尿病并发症AGE-RAGE信号通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)息息相关；在对齐墩果酸研究中发现其会使大鼠的血清甲状腺素[Thyroxin(e)]水平降低和促甲状腺素(TSH)水平升高[22]，同时发现薯蓣皂苷元能显著降低GD大鼠FT3、FT4水平[23]，此外迷迭香酸可抑制细胞自噬[24]，但都无法确定其具体机制。现有文献对其他成分的报道较少，其抗GD的药效及作用机制研究，同样值得进一步研究。

本研究针对由网络分析获得的14个泻火消瘿方治疗GD的作用靶点进行讨论，ESR1通过甲状腺激素通路参与DNA相互作用转录表达，该基因编码雌激素受体[25]；ESR2是属于NR3亚家族核激素受体家族的核蛋白，是一种核激素受体，与雌激素的亲和力类似于ESR1；IGF1R是激素胰岛素样生长因子1(IGF-1)的细胞表面受体；MAPK1是细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其在机体免疫和炎症反应中有重要作用[26]；当细胞在负面状态下，MAPK通路被激活，进而引起细胞增殖、分化和凋亡等方面的改变[27]；MET基因编码的蛋白为肝细胞生长因子受体(HGFR)，与多种癌基因产物和调节蛋白相关，参与细胞信息传导、细胞骨架重排的调控，是细胞增殖、分化和运动的重要因素。以上靶点提示泻火消瘿方可能是通过调节体内激素分泌水平、激活体内免疫系统、促进抗炎反应、加强细胞分化和凋亡机制从而起到治疗GD的效果。

此外，对KEGG和GO得到的结果进行分析时发现，泻火消瘿方或许能够对多种癌症有所影响。其中KEGG条目有癌症通路(Pathways in cancer)、癌症中心碳代谢(Central carbon metabolism in cancer)、TNF信号通路(TNF signaling pathway)等；GO分析得到细胞迁移正向调控(Positive regulation of cell migration)、对外部刺激反应的正向调节(Positive regulation of cell migration)、对有机环状化合物的细胞应答(Cellular response to organic cyclic compound)、对氮化合物的细胞应答(Cellular response to nitrogen compound)等条目，可推测泻火消瘿方或许能够干预多种癌症的进程，但详细的作用机制有待于后期研究。

3.2 从分子层面分析泻火消瘿方的配伍机制

GD病变涉及心、肝、脾三脏，肝郁化火，则见肝火亢旺。母病及子，致心火亢盛。肝木乘脾，脾失健运，酿生痰湿，痰气交阻，血行不畅，气、血、痰壅结颈前，痰气郁结化火，终致心肝火旺。泻火消瘿方重用君药龙胆清泻肝胆实火，清利肝经湿热，臣以夏枯草、黄芩增强君药清肝泻火之力，切合前述GD肝火旺盛的病机。GD损伤肝阴的同时，也会伤及心阴，出现心悸、烦躁、脉数等症。故用生地黄、百合、知母滋阴养血，以使标本兼顾，其中知母既善降火，又能滋阴。反佐穿山龙既防君臣寒凉太过，又防阴伤血涩之变。全方共奏清肝泻火、滋阴宁心之功[12]。

为了进一步阐述泻火消瘿方的配伍机制，对前文网络药理学得出的化学成分药效Degree排序，并进行分析(见图4)，发现其化学成分分布情况与复方药材配伍有极大的相关性。龙胆中有12个化学成分排在前30位，说明其在泻火消瘿方中发挥了君药的重要作用。再以Degree的中位数(Degree=27)为限，对化学成分进行分析，君药龙胆，臣药夏枯草和黄芩的化学成分较多，龙胆有13个化学成分，夏枯草有13个化学成分，黄芩有22个化学成分，而生地黄、百合、知母、穿山龙分别有3、6、6、1个化学成分。推测龙胆为关键药材，夏枯草与黄芩对龙胆具有协同效应，促进和加强其对GD的治疗，生地黄、百合、知母及穿山龙对治疗GD起辅助补充之效。有文献证明夏枯草多糖影响GD小鼠甲状腺激素的合成和分泌[28]；同时，近期研究发现泻火消瘿方中的重要成分黄芩苷可通过抑制mTOR信号通路重塑Tfh/Tfr细胞的平衡[29]；文献报道表明甲亢初期加用百合能够降低Thyroxin(e)水平[30]；知母主要成分知母皂苷能降低异常升高的β受体浓度，降低甲状腺激素对CAMP的激活作用[31]；且穿山龙主要成分薯蓣皂苷元可以缓解甲状腺肿大症状[32]。以上文献可证明复方中的药材可在多方面缓解GD，从而改善GD病况。

夏枯草化学成分中包含7个重复的化学成分，即存在较多重复的分子作用靶点，或可说明其作为臣药辅助龙胆可加强对GD的治疗作用。黄芩化学成分含量占比第一(36/104)，分子作用靶点最多(160)，其中有17个靶点为黄芩所独有的，说明此药是对泻火消瘿方作用靶点的扩充。百合和知母化学成分包含全方中Degree最大的植物甾醇(Degree=132)，且无特有靶点，或可说明其在治疗GD中，起到增强君药与臣药疗效的功用。

由成分-靶点网络(图4)可知重复成分具有较大Degree的化学成分，包括植物甾醇(Degree=132)、西托糖苷(Degree=120)、β-谷甾醇(Degree=107)、豆甾醇葡萄糖苷(Degree=80)、山柰酚(Degree=72)、齐墩果酸(Degree=68)和异荭草素(Degree=65)，同时也是对接较好的成分(表2)。由此可得，单个成分可作用于多个靶点，或多个成分作用于同一个靶点，体现出中药复方多成分、多靶点协同作用的特点。且复方中药材成分相互重合，推测在合理配伍之后，利用其相互间的协同作用，可提高疗效或减少不良反应，适应复杂病情的治疗。

由前述研究可知，泻火消瘿方中7味中药所含共同靶点为227个，其中君药龙胆占154个，臣药夏枯草和黄芩在共同靶点中分别占121、160个，佐药生地黄、百合、知母和穿山龙分别占71、114、149、68个。表明7味药材具有大量的重叠靶点，说明复方药材通过增强共同靶点的作用而改善GD病症，揭示了复方用药的原理。

本研究基于网络药理学和分子对接技术，通过计算机挖掘网络药理学数据库方法对泻火消瘿方进行靶点预测和通路分析，并对其活性成分的抗GD作用机制进行探究。同时借助分子对接技术对泻火消瘿方的核心成分与治疗GD潜在靶点的结合能力进行研究，从而明确泻火消瘿方的主要调控靶点，提示临床用该方治疗GD的合理性，为其后续疗效评价指标的筛选提供依据和方向。