黄柏酮通过影响线粒体功能抑制肾上腺皮质瘤细胞皮质酮合成的研究

谢海纳，潘志强

(上海中医药大学基础医学院，上海 201203)

皮质醇增多症是肾上腺皮质长期分泌过量皮质激素引起的综合征，其中，促肾上腺皮质激素(ACTH)非依赖性皮质醇增多症是由于肾上腺皮质肿瘤或增生导致自主分泌过量皮质醇。血液中高皮质醇通过影响血糖、血脂、电解质和其他激素的平衡，会导致满月脸、向心性肥胖、高血压、痤疮、继发性糖尿病、月经失调、性功能障碍、骨质疏松等临床表现。

中医临床发现皮质醇增多症常伴随阴虚内热证候发生，采用滋阴清热中药比如黄柏、知母、丹皮、生地黄、鳖甲等均有助于改善证候。其中，黄柏是代表性的中药，其性苦、寒，归肾、膀胱经，具有清热燥湿、泻火除蒸、解毒疗疮的功效。现代药理研究表明[1-2]，黄柏含有小檗碱、黄柏碱、黄柏酮等多种活性成分，其中小檗碱具有抗菌、抗炎、解热、降血糖、降血压、免疫调节、抗肿瘤、抗衰老等药理活性，而对黄柏碱、黄柏酮的抗炎、抗肿瘤活性也有散在报道[3-5]。本研究在探索黄柏主要成分对肾上腺皮质激素合成影响过程中，发现黄柏酮具有抑制Y1细胞皮质酮合成与分泌作用，兹报道如下。

1 材料

1.1 药品与试剂

黄柏酮(分子式:C26H30O7，分子量:454.51，分子结构见图1)。

图1 黄柏酮的分子结构

米托坦(Sigma-Aldrich，货号：SML1885);Cell Cycle Staining(联科生物，货号：A92380144)试剂盒；Mito-Tracker Green线粒体绿色荧光探针(上海碧云天生物技术公司，货号：C1048)；Hoechst 33342活细胞染色液(100×)(上海碧云天生物技术公司，货号：C1029)；乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性检测试剂盒(上海碧云天生物技术公司,货号：C0017)。RIPA裂解液(上海碧云天生物技术公司，货号：P0013C)；RNAiso Plus(TaKaRa，货号：9109)，PrimeScript©RT reagent Kit(TaKaRa，货号：RR036A)，SYBR©Premix Ex TaqTM(TliRNaseH Plus)Ⅱ(TaKaRa，货号：RR820A)；小鼠皮质酮ELISA试剂盒(Cayman，货号：501320)，β-actin抗体(Sigma-Aldrich，货号：A5441)；类固醇合成急性调节蛋白(StAR)抗体(Abcam，货号：ab96637)、胆固醇侧链裂解酶(CYP11A1)抗体(Abcam，货号：ab175408)、11β-羟化酶1(CYP11B1)(Abcam，货号：ab229884)、Mitofusin 1(Mfn1)(Abcam，货号：ab129154)、Mitofusin 2(Mfn2)(Abcam，货号：ab124773)。

胎牛血清(Corning，货号：35-015-CV)、100 U/L青链霉素(Corning，货号：30-002-CIa)、DMEM-F12培养液(Corning，货号：10-092-CV)，胰蛋白酶-EDTA溶液(Sigma-Aldrich，货号：T3924)。采用Primer3(v0.4.0)在线软件设计引物并委托Life Technologies公司合成，见表1。

表1 引物序列

1.2 仪器

实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司，QuantStudio 3型)；酶标仪(美国BioTek公司，Elx800型)；台式冷冻离心机(德国Eppendorf公司，5417R型)；小型垂直电泳槽(美国BIO-RAD公司)，转膜仪(Mini-PROTEAN Tetra型)；化学发光凝胶成像系统(美国Protein-Simple公司，Alpha型)；流式细胞仪(美国Beckman公司，CytoFlex S型)；激光扫描共聚焦显微镜(德国Leica公司，SP-8型)。

2 方法

2.1 MTT法检测黄柏酮对Y1细胞活性的影响

Y1细胞种植于96孔板中，每孔细胞密度1×104，次日采用2.5～160 μmol/L黄柏酮干预24 h后，吸弃培养液并用PBS冲洗1次。加入5 g/L的MTT溶液(避光保存)继续在培养箱中培养4 h，弃上液加入150 μL的DMSO，在摇床上避光混匀15 min后，在酶标仪上检测OD570读数值。每个浓度组设4个复孔，独立重复2次实验。

2.2 黄柏酮对细胞毒性(LDH法)的影响

采用含10%血清生长培养液，将Y1细胞种植于96孔板中，次日采用低血清培养液(含体积分数为1%的血清)配药，经过40～160 μmol/L黄柏酮处理24 h后，依据LDH细胞毒性检测试剂盒使用说明，采用Y1细胞培养上液，检测细胞培养液中LDH含量。

2.3 流式细胞术检测黄柏酮对Y1细胞周期的影响

采用6孔板铺板Y1细胞，以80 μmol/L黄柏酮处理24 h，50 μmol/L米托坦作为阳性对照，用0.25%胰酶-EDTA消化，PBS洗1次后采用Cell Cycle Staining试剂盒进行PI单染，避光孵育30 min后在流式仪中检测细胞周期。

2.4 共聚焦显微镜检测黄柏酮对Y1细胞线粒体膜的影响

采用共聚焦显微镜专用培养皿进行铺板，80 μmol/L黄柏酮与50 μmol/L米托坦干预24 h后，吸出培养液，每孔加入1 mL 4%多聚甲醛，固定5～10 min后，PBS洗2次，先用Mito-Tracker Green线粒体绿色荧光探针染色，再用Hoechst 33342活细胞染色液染色，在激光共聚焦下拍摄细胞染色照片。

2.5 ELISA法检测细胞分泌液皮质酮含量

Y1细胞在低血清培养液(血清体积分数为1%)中，经过80 μmol/L黄柏酮处理24 h后，收集细胞培养上清液，依据ELISA试剂盒说明书进行操作，检测未稀释的原液中皮质酮含量。

2.6 qPCR检测黄柏酮对Y1细胞皮质酮合成酶mRNA表达

采用6孔板铺板Y1细胞，以40、80、160 μmol/L黄柏酮干预Y1细胞24 h，及80 μmol/L黄柏酮干预Y1细胞24、36、48 h。按照RNAiso Plus试剂盒说明书抽提细胞总RNA；逆转录反应体系20 μmol/L，反应条件为37 ℃×15 min，85 ℃×5 s，4 ℃；PCR扩增反应体系为20 μL，反应程序为95 ℃×3 min，95 ℃×5 s，60 ℃×30 s，40个循环。采用2-ΔΔCt法分析。

2.7 Western blot检测黄柏酮对Y1细胞皮质酮合成酶蛋白表达

采用6孔板铺板Y1细胞，以80 μmol/L黄柏酮干预Y1细胞24 h，采用RIPA裂解液处理Y1细胞，收集蛋白质样品并予以定量，通过变性处理，分别执行聚丙烯凝胶电泳、转膜、封闭、一抗孵育、洗涤、二抗孵育、再洗涤、显影等实验流程，其中，一抗浓度内参β-actin以1∶20 000稀释，抗体StAR、CYP11A1、CYP11B1均以1∶2 000稀释；Mfn1以1∶10 000稀释；Mfn2以1∶5 000稀释。以β-actin为内参对照，分析蛋白相对表达量。

2.8 统计学方法

3 结果

3.1 黄柏酮对Y1细胞活性的影响

采用2.5～160 μmol/L黄柏酮干预Y1细胞24 h，MTT法检测细胞OD570读数值。结果显示，与对照组比较，2.5～40 μmol/L黄柏酮对细胞的抑制率约为35%(P<0.01)，160 μmol/L黄柏酮对细胞抑制率达60%以上(P<0.01)。提示黄柏酮可以显著抑制Y1细胞活性。进而检测黄柏酮对细胞毒性的影响，结果显示，80 μmol/L以上黄柏酮对Y1细胞有10%～20%的毒性作用。见图2。

注：与对照组比较，。

3.2 黄柏酮对细胞周期的影响

结果见图3。与对照组比较，80 μmol/L黄柏酮与50 μmol/L米托坦均导致G1期细胞显著增加(P<0.01)，表明黄柏酮具有阻滞Y1细胞周期于G1期的作用。

注：与对照组比较，。

3.3 黄柏酮对Y1细胞线粒体膜的影响

与对照组比较，米托坦处理后细胞线粒体增亮；黄柏酮处理后细胞线粒体更加明亮，提示黄柏酮可能通过影响线粒体膜扩张导致线粒体膜更加丰富，从而影响线粒体膜类固醇激素合成酶功能及其皮质酮合成过程，见图4。进而检测了黄柏酮对线粒体膜蛋白表达，发现黄柏酮显著抑制Mfn1、Mfn2蛋白表达(P<0.01)，提示黄柏酮可影响线粒体功能，见图5。

对照组 米托坦组 黄柏酮组

注：与对照组比较，。

3.4 黄柏酮对Y1细胞皮质酮分泌的影响

与对照组比较，黄柏酮可降低皮质酮含量，提示黄柏酮可能具有抑制Y1细胞皮质酮分泌的作用，见图6。

注：与对照组比较，

3.5 不同浓度黄柏酮对Y1细胞皮质酮合成酶基因表达的影响

本实验采用40～160 μmol/L黄柏酮干预Y1细胞24 h，检测皮质酮合成酶基因表达。与对照组比较，各浓度黄柏酮均显著抑制Cyp11a1、Cyp11b1、Hsd3b2、SF-1基因表达(P<0.05～0.01)，160 μmol/L黄柏酮显著增强Star、Cyp21a1、Nr4a1、Nr4a2基因表达(P<0.01)，见图7。由于Star、Cyp11a1、Cyp21a1、Cyp11b1是皮质酮合成的重要酶的基因，Nr4a1、Nr4a2、SF-1、Hsd3b2是调节各酶的重要转录因子，提示黄柏酮主要通过抑制皮质酮合成酶基因表达，抑制皮质酮合成过程。

注：与对照组比较，。

3.6 黄柏酮48 h对Y1细胞皮质酮合成酶基因表达的影响

进一步检测黄柏酮延长给药至48 h后对Y1细胞类固醇激素合成酶基因表达的影响。与对照组比较，黄柏酮持续给药48 h内，均显著抑制Cyp11a1、Cyp21a1、Cyp11b1、Hsd3b2基因表达(P<0.01)，然而促进Star基因表达(P<0.01)，见图8。

注：与对照组比较，。

3.7 黄柏酮对Y1细胞皮质酮合成酶蛋白表达的影响

与对照组比较，黄柏酮与米托坦均显著抑制CYP11A1和StAR蛋白表达(P<0.01)，见图9，提示黄柏酮可能主要通过CYP11A1酶发挥抑制皮质酮生成的作用。

注：与对照组比较，

4 讨论

肾上腺皮质细胞是合成皮质激素的主要场所(人类有活性的是皮质醇，啮齿动物有活性的是皮质酮)。皮质激素合成以胆固醇为原料，经线粒体外膜StAR接受胆固醇后快速转运到线粒体内膜，在线粒体内膜P450侧链裂解酶(P450scc，由Cyp11a1基因编码)作用下，胆固醇裂解为孕烯醇酮，再经线粒体-内质网相关连接膜(Mitochondria-ER associated membranes,MAMs)转运到内质网，在内质网相关酶3β-HSD、CYP21A作用下合成各种类固醇激素的中间产物，最后类固醇激素中间产物经MAMs返回穿梭至线粒体内，在CYP11B1作用下合成皮质酮。因此，皮质酮合成量主要受线粒体膜上重要酶的影响，肾上腺皮质癌一线治疗的靶向药物米托坦的药理作用机制正是通过作用于线粒体抑制了类固醇激素合成酶的活性，从而阻止了皮质细胞激素的合成过程。

临床皮质醇增多症所致的阴虚内热常使用黄柏，因此，本研究选择黄柏所含成分黄柏酮进行了研究。黄柏酮主要来源于芸香科柑橘属、能清热解毒燥湿的黄柏、白鲜皮等，研究发现黄柏酮具有抗炎[6-7]、防治肺损伤和肺纤维化[8]等作用。此外，黄柏酮在乳腺癌、胰腺癌、结肠癌等多种癌症中具有抑制细胞增殖和促进细胞凋亡的作用[9-12]，也可通过下调Akt磷酸化水平来抑制血管平滑肌细胞的增殖，减轻内膜增生，抑制静脉桥再狭窄的发生[13]。本研究发现黄柏酮具有显著抑制Y1小鼠肾上腺皮质瘤细胞活性，且黄柏酮与米托坦一样，均显著阻滞细胞于G1期，提示黄柏酮可以通过阻滞细胞周期以抑制细胞增殖。

值得注意的是，本研究重点探索了黄柏酮对线粒体膜的影响，通过共聚焦显微镜，发现黄柏酮可以导致Y1细胞线粒体膜亮度增强，进一步检测了线粒体膜上重要的标志性蛋白Mfn1与Mfn2，以及合成皮质酮的线粒体膜类固醇激素合成酶，发现黄柏酮可抑制Cyp11b1基因表达，提示黄柏酮可以通过影响线粒体膜结构及相关功能分子，从而抑制皮质酮合成与分泌。此外，黄柏酮还显著抑制了定位于内质网的脱氢酶HSD3B2与胞浆中的转录因子SF-1，SF-1参与类固醇激素合成酶CYP11A1、CYP11B1、HSD3B2的调控作用，且随着给药时间延长，上述基因被抑制得更加显著，提示黄柏酮可能靶向作用于类固醇激素合成酶及其转录调控因子，从而抑制了皮质酮合成过程。然而，160 μmol/L黄柏酮却显著增强孤儿核受体Nr4a1、Nr4a2基因表达，也促进Star与Cyp21a1基因表达，其中，Star、Nr4a1、Nr4a2属于即刻早期基因，Cyp21a1可转录定位于内质网上的皮质酮前体物质合成酶，提示黄柏酮处理Y1细胞后，可能导致细胞代偿性反应。

综上所述，本研究发现了黄柏酮可抑制肾上腺皮质激素合成与分泌，临床使用黄柏治疗具有阴虚内热证的皮质醇增多症患者，黄柏酮是其药效发挥的重要物质基础。