微粉化对姜黄色素粉体学性质及溶出度的影响研究

仝萌，于翔羽，李淑坤，胡子奇，汪晶，舒娈

(1.南京中医药大学附属中西医结合医院，江苏 南京 210028；2.江苏省中医药研究院国家中医药管理局中药释药系统重点研究室，江苏 南京 210028)

姜黄色素是一种多酚类化合物，其分子结构中含有多个双键，以及酚羟基、羰基等活性基团，在抗菌[1]、抗氧化[2-3]、抗病毒[4]、免疫调节[5-6]、抗炎[7]等领域发挥着重要的作用。尽管目前对其疗效颇具争议，但它仍是世界上销量最大的七大天然食用色素之一，是被WHO和FDA公认的天然食品添加剂[8]。姜黄色素是一种具有代表性的多成分中药组分，其中姜黄素、去甲氧基姜黄素2种单体成分占姜黄色素含量90%以上，分子结构式见图1。姜黄色素由于几乎不溶于水，稳定性较差，口服生物利用度较低，应用受到限制。因此，众多学者将其作为模型药物，利用纳米制剂技术来改善其理化性质，寄以提高其口服生物利用度[9-10]。

A.姜黄素；B.去甲氧基姜黄素

微粉化技术是采用机械或者流体动力等将物料粉碎成微米级甚至纳米级粉体的过程，具有加快药物溶出、提高生物利用度等优势。国内学者对此进行了深入的研究[11-13]，但大多局限于中药单体活性成分，缺乏对于难溶性中药组分的深入研究。本文在课题组先前研究基础上[14]，拟采用微粉化技术对姜黄色素进行处理，获得不同粒径的微粉，并对其微观形态、粉体学性质、体外溶出度及稳定性进行考察，以期评估微粉化技术对于难溶性中药组分的应用前景和进一步制剂成型的研究意义。

1 材料

激光粒度分析仪LS13320/ULM2(美国贝克曼库尔特公司)；200F3型示差扫描量热仪(德国NETZSCH科技有限公司)；ZEISS-SUPRA40型扫描电镜(德国蔡司公司)；Bruker-D8型X-射线衍射仪(德国布鲁克公司)；XQM-KL-8低温行星球磨机(长沙天创粉末技术有限公司)；XP-6型百万分之一精密天平(瑞士梅特勒-托利多国际股份有限公司)；ZRS-8GD型智能溶出试验仪(天津市天大天发科技有限公司)；Agilent 1100型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；姜黄色素(批号：JZ18042917，南京景竹生物科技有限公司)；姜黄素对照品(批号：A1917105，纯度>98%，阿拉丁试剂)；去甲氧基姜黄素对照品(批号：JZ18032202，纯度>98%，南京景竹生物科技有限公司)；甲醇、乙腈为色谱纯(美国天地公司)，水为超纯水(美国Milli-Q公司)，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 姜黄色素微粉的制备

称取一定量干燥的姜黄色素粉末，加入低温行星式球磨机中，设定转速为200 r/min，温度为5 ℃，大球∶中球∶小球的质量比为2∶5∶3，研磨时间分别为60、90、120 min，分别研磨得到姜黄色素微粉1、微粉2、微粉3，置于干燥器内备用。

2.2 粒径与粒度分布

分别取适量的姜黄色素原粉和微粉于专用塑料量杯中，放置于激光粒度分析仪内，开启真空状态，测定其粒径及粒径分布。粒径分布见表1，结果表明，姜黄色素原粉平均粒径为57.20 μm，通过微粉化后，姜黄色素粉末粒径明显变小，且有部分粒径处于纳米级别。

表1 粒径分布测定结果

2.3 休止角和卡式指数

采用固定圆锥底法测定姜黄色素原粉及微粉的休止角，取一定量的待测粉末，在固定的振幅下使粉末通过漏斗均匀流出，至最高的圆锥体位置，测量圆锥体斜面与平面的夹角，重复3次，取平均值，即为待测粉末的休止角。给予一定强度的振动，使粉末均匀流入10 mL的量筒，刮去杯子上面多余的粉末，称质量，计算松密度(松密度=质量/10)。同时对杯子给予一定强度的撞击(180次，3 min)，刮去多余的粉末，称质量，计算轻敲密度(轻敲密度=质量/10)。计算卡式指数[卡式指数=(1-松密度/轻敲密度)×100%][14]。卡式指数反映粉末的压缩性和流动性。卡式指数大，粉末通常可压性好，但是流动性差；卡式指数小，粉末流动性好，但可压性差。休止角及卡式指数的结果见表2。

表2 姜黄色素不同粉末的休止角和卡式指数

结果表明：姜黄色素微粉的休止角随粒径的减小略有增大，与原粉相比，流动性变差。随着微粉粒径减小，卡式指数明显增大，表明粉末的流动性明显变差。这可能是由于姜黄色素经微粉化处理后，粒径变小，黏附性增强，且研究过程中出现明显的团聚现象，所以流动性较差，同时松密度和轻敲密度先增大后减小，这可能一方面和粉末的不均匀性有关，另一方面，微粉化处理后，随着微粉的增加，出现团聚现象，同时也存在微粒间的排斥力，所以会出现松密度和轻敲密度上升的趋势。

2.4 吸湿性考察

将底部盛有氯化钠过饱和溶液的玻璃干燥器放入恒温培养箱中(25 ℃)恒温24 h，此时干燥器内的相对湿度为75%。根据2015年版《中国药典》药物引湿性试验指导原则，精密称定干燥至恒质量的4种姜黄色素粉末适量，放置于恒质量的称量瓶内，准确称质量后置于干燥器中，25 ℃恒温保存，于2、4、6、8、24、48 h定时称量。吸湿率=(吸湿后质量-吸湿前质量)/吸湿前质量×100%，结果见图2。由于姜黄色素不溶于水，其吸湿性低，通过微粉化处理后的3种粉末，其吸湿增质量均小于1%，与原粉相比无显著区别。

图2 姜黄色素粉末吸湿速率曲线

2.5 姜黄色素中指标性成分含量测定

2.5.1 色谱条件及系统适应性考察 采用Waters X-Bridge色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：乙腈-0.3%冰醋酸(55∶45)等度洗脱；检测波长430 nm；流速1 mL/min；柱温25 ℃；进样量10 μL。见图3。

A

2.5.2 线性关系考察 精密称取去甲氧基姜黄素对照品3.250 mg，姜黄素对照品7.195 mg置于25 mL容量瓶中，甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得到130 μg/mL去甲氧基姜黄素，287.8 μg/mL姜黄素的混合对照品储备液。用甲醇稀释成7个不同的质量浓度。按照上述色谱条件进样，以对照品溶液的进样浓度(X)为横坐标，峰面积积分值(Y)为纵坐标，绘制去甲氧基姜黄素标准曲线Y=79 301X-45 591，R2=0.999 9，线性范围为0.650 0～130.0 μg/mL；姜黄素标准曲线Y=71 137X+66 371,R2=0.999 7，线性范围为1.439～287.8 μg/mL，结果表明线性关系良好。

2.5.3 精密度试验 精密吸取标准品溶液10 μL，连续进样6次，在上述色谱条件下测定，记录峰面积，去甲氧基姜黄素及姜黄素峰面积的RSD分别为0.14%，0.24%，说明仪器精密度良好。

2.5.4 稳定性试验 精密吸取样品溶液，分别在0、2、4、6、8、12、24 h进样，在上述色谱条件下进样测定，计算姜黄素峰和去甲氧基姜黄素峰面积的RSD值。结果表明去甲基姜黄素及姜黄素在24 h内稳定，RSD分别为0.51%，0.66%。

2.6 微观结构研究

2.6.1 电子扫描显微镜(SEM) 采用喷金法观察表面结构。将4种姜黄色素粉末分别放置于玻璃皿内，离子溅射后用SEM观察样品表面结构，加速电压为25.0 kV，放大2 000倍，结果见图4。

注：A.原粉；B.微粉1；C.微粉2；D.微粉3

结果表明：姜黄色素原粉中多为大块颗粒状物质，通过不同研磨工艺后，粉体的粒径逐渐减小，与粒径测定的结果一致，微粉2和微粉3中微粒明显增多，在微粉2和微粉3中仍出现一部分大颗粒，一方面可能是研磨不均匀，导致存在少量的大块颗粒，另一方面更多的可能是由于微粉粉体的表面积变大，表面自由能增加，使得粉末相互吸引，产生团聚现象。

2.6.2 差示扫描量热法(DSC) 测试条件为铝坩埚；载气为氮气；升温速率10 ℃/min；升温范围30～250 ℃；分别对4种粉末进行DSC分析，结果见图5。

A.原粉；B.微粉1；C.微粉2；D.微粉3

由图5可见，4种姜黄色素粉末的DSC曲线峰朝下且较尖锐，说明在转态时放热明显，原粉在178 ℃左右有一明显放热峰，随着粒径减小，粉末熔点略微降低，微粉3的熔点在176 ℃，表明4种粉末熔点基本一致，微粉化未引起姜黄色素熔点的明显变化，经微粉化处理的3种粉末，其放热峰值明显比原粉高，表明姜黄色素粉末粒径越小，DSC的放热峰面积越大，推测可能是随着粒径减小，粉末的堆积度增大，导热性能提升。

2.6.3 X-射线粉末衍射法(XRD) 测试条件为Cu靶(40 kV,40 mV)；步进扫描0.02°/步；扫描范围5°～90°；扫描速度4°/min。XRD结果见图6。

A.原粉；B.微粉1；C.微粉2；D.微粉3

姜黄色素原粉在15°、17°、23°、25°、27°有较强吸收峰，随着粒径的减小，不同粒径微粉在上述吸收段的峰值明显减弱，推测可能是由于粉末粒径的减少，导致细小的晶粒之间容易由于弱的相互作用力结合在一起，导致晶粒之间发生团聚，影响了晶面取向的随机性，导致吸收峰降低。

2.7 体外溶出度考察

溶出度测定方法按照《中国药典》2015版溶出度测定第二法桨法，分别称取一定量的4种不同粒径的粉末，以含0.3%吐温80的pH1.2的盐酸溶液和含0.3%吐温80的pH6.8的磷酸盐缓冲液为溶出介质，转速100 r/min，温度(37±0.5)℃，分别于5、10、15、30、45、60、90 min取样2 mL(同时补加同温度等量溶出介质)，以0.45 μm微孔滤膜过滤，弃去初滤液，取续滤液10 μL按2.4项下色谱条件进行测定，测定结果代入标准曲线计算浓度，并换算成累计溶出率，以时间为横坐标，累计溶出率为纵坐标作溶出曲线图，结果见图7。

图7 姜黄色素在不同pH溶出介质中的溶出曲线(n=3)

由图7可见，在含0.3%吐温80的pH1.2盐酸溶液中，原粉在5 min时，去甲氧基姜黄素、姜黄素溶出度分别为8.98%、3.46%；90 min内累计溶出率分别为40.13%、34.43%。在微粉3中，5 min时去甲氧基姜黄素、姜黄素的溶出度分别为19.97%、20.11%；90 min内累计溶出率分别为72.67%、77.15%。在含0.3%吐温的pH6.8的磷酸盐缓冲液中，原粉在5 min时，去甲氧基姜黄素、姜黄素溶出度分别为8.8%、3.22%；90 min内累计溶出率分别为38.06%、30.29%。而在微粉3中，5 min时去甲氧基姜黄素、姜黄素溶出率分别达20.46%、19.22%，90 min内累计溶出率分别为77.55%、76.75%。微粉1及微粉2亦呈现相类似的趋势，由此可见，随着微粉粒径的减小，溶出率明显增大，溶出性能得到显著提高。

2.8 稳定性实验

将4种姜黄色素粉末放置于稳定性箱中，置加速条件下考察其稳定性(40 ℃，RH75%)，放置3个月后按“2.6”项下条件测定其体外溶出度，结果见图8。与0月相比，姜黄色素中去甲氧基姜黄素和姜黄素溶出度均略有下降，可能是微粉粉末发生了部分团聚，但是微粉3中2种成分累计溶出度仍能达到70%以上，表明姜黄素微粉可以保持一定的稳定性，但是仍需要更优的方式保持微粉的分散状态。

图8 加速3月后姜黄色素微粉在不同pH溶出介质中的溶出曲线(n=3)

3 讨论

本实验采取了球磨法制备姜黄色素微粉，对微粉化前后的姜黄色素的粉体学性质和溶出度进行了系统化的比较和分析。姜黄色素经过微粉技术处理后，粒径明显减小，无定形物明显增多，流动性变差，压缩度增加，体外溶出速率及累计溶出度明显改善；但是粒径并不是随着球磨时间的增加而减少，物料的粒径会经历“快速变化-缓慢变化-平衡区-逆粉碎区”4个阶段变化[11-12]，其粒径大小与球磨时间、球料比、球磨转速、温度等因素密切相关[15]，在进行微粉化处理时，需结合中药组分性质与生产成本等因素进行综合考虑。同时，微粉化后体外溶出度的改变也会导致口服生物利用度的变化，甚至也可能会导致刺激性效应的增大，因此，针对难溶性中药组分的微粉化技术还需要更全面、更深入、更细致的研究。

稳定性试验结果表明，初步制备的姜黄色素微粉在长时间储存后，由于静电、沉降等因素出现部分团聚现象，导致体外溶出度改变；在微粉制备过程中，是否可以加入不同性质的新型安全辅料，进行共微粉化制备，从而改善粉体的性质，本课题组就这一问题已进行初步探讨，后续将进行进一步的研究。