褪黑素对人牙周膜细胞成骨分化能力的影响

张梦涵，何智琪，邓 辉，胡荣党

牙周炎是牙周致病菌感染从而影响牙周组织的一组慢性炎症性疾病。牙周炎涉及牙槽骨的进行性丢失，如果不加以治疗，就会导致牙齿的松动和随后的脱落[1-2]。目前，治疗牙周炎的方法主要分为基础治疗与外科手术治疗，其治疗目的不仅仅是为了控制炎症，更重要的是实现牙周组织的再生和新附着的形成[3]。

目前，实现牙周组织再生中的细胞和基因疗法应用已引起人们的广泛关注[4]。人牙周膜细胞(human periodontal ligament cells，hPDLCs)是牙周膜中的功能细胞，被认为是重建牙槽骨、牙骨质和牙周膜的理想细胞类型[5]。hPDLCs能向成纤维细胞、成骨细胞等分化，并形成矿化组织，在牙周修复再生中起到关键作用。因此如何促进hPDLCs成骨分化是实现牙周组织再生的重点之一[6]。

褪黑素(melatonin)是由松果体和其他器官以昼夜节律模式合成并分泌的吲哚胺，具有多种生物学特性，在免疫、抗氧化、抗炎、防止外部细菌损伤与提高牙槽骨质量等方面发挥重要作用[7]。有文献报道褪黑素可促进成骨细胞增殖和分化[8]，降低破骨细胞相关的骨吸收[9]，表明了其具有调节骨代谢的作用。相关临床和体外研究也记录了褪黑素对牙周炎的治疗作用[10-11]。然而，有关褪黑素能否通过促进牙周骨质新生，从而在牙周再生中发挥作用，目前罕见报道。为此，本研究从细胞分子水平探讨褪黑素对hPDLCs成骨分化能力的影响，为今后褪黑素在牙周再生中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

1.1.1 主要试剂 培养基、胎牛血清(Gibco，美国)；褪黑素、茜素红S、MTT(Sigma，美国)；SYBR Green Ⅰ染料(Roche，美国)；反转录试剂盒(Takara，日本)；引物、Trizol试剂(Invitrogen，美国)；碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性检测试剂盒(南京建成)；ALP染色试剂盒、BCA试剂盒、山羊抗小鼠二抗(上海碧云天)；Ⅰ型胶原(collagenase-Ⅰ，Col-Ⅰ)、Runx2蛋白多抗、β-actin单抗、兔抗山羊二抗(CST，美国)；OSX蛋白多抗(Abcam，美国)。

1.1.2 主要仪器 PCR扩增仪、化学发光仪、电泳转膜仪(Bio-Rad，美国)；荧光定量PCR仪(Roche，美国)；酶标仪(TECAN，瑞士)。

1.2 实验方法

1.2.1 hPDLCs的培养与鉴定 样本选自本单位外科门诊就诊患者的阻生第三磨牙。患者为18～30岁，口腔卫生良好，牙体无龋损，牙周组织无炎症。牙拔除后立即用无菌PBS反复冲洗，超净台中提取根中1/3的牙周膜，修剪，消化液37 ℃消化30 min，离心(1 000 r/min)5 min，弃上清，转移至含有培养液的T25培养瓶中。将培养瓶置于37 ℃、5% CO2的条件下培养24 h后，补加2 mL培养液。每3 d换液，7 d左右可见细胞自组织块中爬出，待细胞长满至80%后，消化传代并记为第1代，相关蛋白染色鉴定其来源，取3～5代细胞用于实验。本研究经本单位医学伦理委员会批准，患者签署知情同意书。

1.2.2 实验分组 以DMSO将褪黑素配制成10 mmol/L母液，根据实验要求将其稀释。将hPDLCs接种至6孔板，密度为5×104个/mL。当细胞融合至70%～80%后，弃液，以1、10、50和100 μmol/L 的浓度设置4个实验组，0.1% DMSO作为对照组。根据MTT结果决定后续实验组的用药浓度。

1.2.3 MTT法测定褪黑素对hPDLCs增殖的影响 于96孔板中接种hPDLCs，加入培养液100 μL/孔，24 h后弃液。以不同浓度的褪黑素分别培养1、3、5和7 d后，弃液，加MTT 20 μL/孔，37 ℃、5% CO2避光孵育4 h，加DMSO 150 μL/孔。震荡溶解后，酶标仪测OD490值。以无细胞的单纯培养液作为空白对照，设置3个复孔。

1.2.4 ALP染色 预实验的结果显示，与3 d和11 d相比，褪黑素孵育7 d后hPDLCs呈现较高的ALP表达。故选择各组细胞在培养7 d后，换成骨诱导液培养，每3 d换液，连续诱导7 d后，根据说明书行染色后，镜下拍照。

1.2.5 ALP活性测定 各组细胞培养7 d后，根据说明书操作，以各孔OD520值换算出ALP活性值，实验重复3次，每组设3个复孔。

1.2.6 茜素红S染色 各组细胞诱导至21 d时，弃液，PBS洗净，加固定液于4 ℃固定30 min，行茜素红S染色，镜下观察拍照后，加入氯化十六烷基吡啶溶液。震荡溶解结节后，酶标仪测每孔OD560值，每组设3个复孔。

1.2.7 实时荧光定量PCR(Real-time PCR) 根据预实验的结果，选择将褪黑素孵育6 h及24 h后提取细胞样本的RNA。应用Trizol试剂提取后，根据OD比值测定样本纯度。样本纯度合格后，根据RT-PCR试剂盒的说明书在冰上进行操作，PCR扩增仪中行逆转录，反应条件：37 ℃、15 min，85 ℃、5 s。引物序列如表1所示。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

使用荧光定量PCR仪进行检测。设3个复孔，根据各基因Ct值，通过公式2-ΔΔCt，计算出各组mRNA的相对水平。重复3次，取平均值。

1.2.8 Western Blot 根据预实验的结果，褪黑素孵育7 d后，细胞裂解液裂解细胞30 min并移至EP管内。使用试剂盒进行定量。将煮沸后的样本通过电泳分离后，转移至PVDF膜上，封闭剂封闭2 h。一抗4 ℃孵育过夜后，以对应的二抗室温摇床孵育2 h，最后以ECL增强化学发光显带，按照试剂说明书进行曝光、拍照。

1.3 统计学方法

2 结 果

2.1 hPDLCs原代培养及鉴定

原代培养1周后，镜下可观察到组织块周围有少量、稀疏的细胞爬出(图1A)，2周后细胞密集生长，呈放射状。传代1 d后细胞生长旺盛，大多为长梭形(图1B)。免疫组化染色可见波形蛋白染色呈阳性(图1C)，角蛋白染色呈阴性(图1D)，证实细胞来源自于中胚层。根据形态学结果并结合取材部位可确定是hPDLCs。

A：培养7d可见细胞爬出；B：传代后细胞长梭形生长；C：抗波形蛋白染色呈阳性；D：抗角蛋白染色呈阴性

2.2 褪黑素对hPDLCs增殖的影响

不同浓度褪黑素作用于hPDLCs的MTT结果如图2所示。褪黑素刺激1 d时，各组OD值无明显差异。随着时间延长，褪黑素组OD值较对照组明显减少，表明hPDLCs的增殖活力受到抑制，且50 μmol/L与100 μmol/L较高浓度的褪黑素组抑制最为显著(P<0.01)。所以，选择1和10 μmol/L作为后续实验组的浓度。

2.3 褪黑素对hPDLCs ALP染色和活性的影响

通过 ALP 染色和 ALP 活性来评价hPDLCs的早期成骨分化。与对照组相比，各褪黑素组ALP表达均有所上升。随着褪黑素浓度的增加，ALP 染色逐渐加深(图3A、B)；如图3C所示，ALP的活性亦呈现相似的变化，10 μmol/L组上升最为明显(P<0.01)。

与对照组相比，*：P<0.05，†：P<0.01

与对照组相比，*：P<0.05，†：P<0.01

2.4 褪黑素对hPDLCs矿化结节形成的影响

通过茜素红S染色来评价hPDLCs的晚期成骨分化。染色结果显示，随着褪黑素浓度的增加，矿化结节的数量逐渐增多。肉眼可见褪黑素组染色加深(图4A)，镜下可见红色矿化结节，结节中心黑红色，四周云雾状(图4B)。图4C定量分析结果同样表明，加入褪黑素后，矿化结节数量呈浓度依赖性增多(P<0.01)。

2.5 褪黑素对hPDLCs 成骨mRNA和蛋白表达的影响

Real-time PCR和Western Blot结果发现，褪黑素处理可以上调hPDLCs表达成骨相关mRNA和蛋白的表达水平。如图5A所示，1 μmol/L浓度的褪黑素处理6 h时，hPDLCs的Col-Ⅰ mRNA表达少许增高，但较对照组未见显著差异(P>0.05)；进一步处理至24 h，1 μmol/L浓度的褪黑素组hPDLCs的Col-Ⅰ mRNA明显升高，约为空白组的2倍(P<0.01)。10 μmol/L较高浓度的褪黑素6 h及24 h均略微抑制Col-I mRNA的表达(P<0.01)。如图5B所示，褪黑素处理hPDLCs 6 h时，Runx2 mRNA的表达均高于对照组，且随浓度增加而上升(P<0.01)。进一步处理至24 h时，褪黑素组Runx2 mRNA的表达量较对照组稍高，但无显著差异(P>0.05)。如图5C所示，褪黑素处理hPDLCs 6 h及24 h时，1 μmol/L浓度的褪黑素组hPDLCs的OSX mRNA表达均少许减少，但较对照组未见显著差异(P>0.05)。褪黑素处理6 h时，10 μmol/L浓度的褪黑素组略微抑制hPDLCs的OSX mRNA表达(P<0.05)。随着时间的延长，高浓度褪黑组抑制效果增加(P<0.01)。Western Blot结果表明，与对照组相比，褪黑素作用7 d后Col-Ⅰ、Runx2和OSX蛋白表达均有明显上升，且1 μmol/L组表达水平达到最高(P<0.01)，见图5D、E。

与对照组相比，*：P<0.05，†：P<0.01

与对照组相比，*：P<0.05，†：P<0.01

3 讨 论

牙周炎是一类炎症性疾病，以炎症和牙槽骨吸收为特征[1]。虽然目前有各种手术和非手术治疗方法，但全球牙周炎的患病率仍然非常高(40%～90%)[12]。传统的治疗方法对于控制牙周炎的进展有一定疗效，但已被破坏的牙周组织却难以恢复。因此，如何实现牙周组织尤其是牙槽骨的功能性再生一直是人们关注和研究的热点，且已成为当前牙周再生治疗、修复前和种植前外科手术研究的重要目标之一[13]。近年来牙周组织工程的发展为实现牙周组织再生的目标提供了新的思路[14]。其中，位于牙骨质和牙槽骨之间的hPDLCs因其干细胞特性，具有良好的增殖和分化能力，且能够分泌调节结缔组织和骨组织稳态的因子，在牙周再生中起着重要作用，被认为是牙周支持组织再生和修复的一种有前景的资源[15]。因此，如何促进hPDLCs骨向分化，诱导其分化形成新的牙周组织，是牙周再生治疗的关键[5]。

褪黑素是一种由松果体、视网膜、骨髓、肠道和免疫系统等多种器官分泌的吲哚胺[7]。它是一种无毒的内源性化学介质，有研究表明其除了具有抗炎、抗菌、抗氧化和免疫增强作用外[16]，还能促进细胞增殖分化和骨重塑[11]，可能对延缓牙周病的发展有一定的作用。Balci等体内实验研究表明，施用褪黑素可降低患有牙周炎的糖尿病大鼠的破骨细胞活性和牙槽骨丧失程度[17]。Roth等研究表明，在MC3T3-E1成骨细胞系中，褪黑素能够促进成骨细胞分化以及矿化[18]。Arabac等研究表明，褪黑素治疗可显著抑制局部牙槽骨吸收，并有助于牙周组织的愈合[10]。Kim等发现褪黑素可以通过下调NF-κB途径抑制破骨细胞分化少。但褪黑素对牙周膜细胞骨向分化的影响尚罕见报道[19]。

因此，我们研究了褪黑素对体外原代培养hPDLCs成骨分化的影响。本实验培养出hPDLCs，并证实其中胚层来源。MTT结果显示，褪黑素浓度对细胞增殖活力的影响较大。其中，50 μmol/L与100 μmol/L高浓度的褪黑素对hPDLCs具有一定的抑制作用。

ALP是成骨细胞分化早期出现的一种关键酶，能促进骨基质的矿化，可促进骨形成与矿化[20]。本研究发现，不同浓度的褪黑素作用于hPDLCs 7 d均可促进细胞ALP活性与表达，且10 μmol/L高浓度褪黑素组上升程度明显高于1 μmol/L低浓度褪黑素组。该结果表明高浓度褪黑素可促进hPDLCs的早期成骨分化。

进一步采用茜素红S染色检测褪黑素对hPDLCs矿化结节的影响。hPDLCs在含有地塞米松、抗坏血酸及维生素C等成分的成骨诱导液培养基内生长21 d，能向成骨细胞转化并产生独特的矿化结节，其在茜素红S染液的作用下呈红色。实验组在褪黑素作用后，茜素红S染色可见大量红色矿化结节，表明褪黑素能明显促进矿化结节的形成。

最后，采用实时荧光定量PCR和Western Blot检测Col-Ⅰ、Runx2以及OSX的mRNA和蛋白表达水平。Col-Ⅰ是成骨细胞分泌的骨蛋白之一，在成骨细胞的分化、骨组织的修复重建以及维持骨强度方面发挥重要作用[20]。Runx2是一种特异的转录因子，可诱导部分前体细胞分化为成骨细胞，进而调控成骨细胞的成熟[21]。OSX在骨组织形成和重建的初始调控中起着重要的作用[22]。因此将3种蛋白作为检测成骨分化情况的指标。本实验检测了不同时间点不同浓度的褪黑素对hPDLCs Col-I、Runx2和OSX的mRNA以及蛋白表达水平影响。

荧光定量PCR结果显示，褪黑素可促进成骨相关mRNA的表达，但在不同浓度、不同的时间点所起的作用有所差别。1 μmol/L的褪黑素作用hPDLCs 6 h时，实验组与对照组的Col-Ⅰ mRNA表达无明显差异，这可能是由于Col-Ⅰ位于Runx2信号途径的下游，其表达受Runx2的调控，褪黑素作用6 h还不足以引起它们表达水平的明显增加。随着作用时间延长，Col-Ⅰ mRNA表达量逐渐升高且高于对照组。而较高浓度的褪黑素则会抑制Col-Ⅰ mRNA的表达，这与马勇等研究发现褪黑素浓度越高，越能抑制肝星状细胞Col-Ⅰ mRNA表达的结果[23]一致。Runx2 mRNA的荧光定量PCR结果表明，在褪黑素作用hPDLCs 6 h时其表达可明显上升，24 h时与对照组无显著差异，这可能是因为Runx2是促进成骨的早期转录因子，它在成骨分化的早期表达较高[24-25]。10 μmol/L的褪黑素作用6 h及24 h时，OSX mRNA表达均显著减少，这可能是时间点的选择以及高浓度的褪黑素抑制OSX mRNA的表达的结果。

Western Blot结果发现，褪黑素作用于hPDLCs 7 d后上述成骨相关蛋白的表达明显上升，尤其是在1 μmol/L的褪黑素作用下上升最为明显。Western Blot结果与荧光定量PCR结果不完全一致的原因，可能是因为检测的时间点不同。

综上所述，褪黑素可上调hPDLCs的ALP活性和表达，促进其矿化结节的形成以及相关成骨mRNA和蛋白的表达，具有一定的促进牙周成骨作用，可能是促进牙周炎牙槽骨形成和重建的一种有前景的治疗策略。褪黑素促进成骨的具体机制及其效应还需进一步阐明。