基于流式细胞术的舟山泽陆蛙基因组大小测定

王伊宁，徐晓晖,2，金园庭，翟韵萍，邵 罡

(1.中国计量大学生命科学学院，浙江杭州 310018;2.中国计量大学现代科技学院，浙江杭州 310018)

泽陆蛙Fejervarya limnocharis，属无尾目Anura，叉舌蛙科Dicroglossidae，陆蛙属Fejervarya，它是我国南方蛙类优势种之一，广泛分布于稻田、沼泽、森林等环境[1]。它又称稻米蛙，在稻田生态系统中是优势甚至唯一的蛙类，维持泽陆蛙种群数量对维护农业生态系统的健康，以及病虫害的生物防治有重要意义。然而，由于人类干扰，以及农药的过度使用，泽陆蛙数量急剧减少，开展泽陆蛙的遗传保护研究对日后开展其科学的种群保护意义重大。舟山泽陆蛙与大陆地区的泽陆蛙种群形成了线粒体进化的两大分支，且与日本分布的泽陆蛙种群亲缘关系更近，具有遗传分化研究的重要意义[2]，目前我国对泽陆蛙的研究报道还很少。

基因组大小(C-值)是指一个生物的单倍体DNA 含量，它是开展基因组高通量测序研究必须首先要考虑的一个重要指标。在真核生物中，每个物种的单倍体基因组DNA 总量是高度恒定的，每个物种各有其特定的基因组大小，C-值可作为每个物种的一个特异性参数[3]。

目前，随着科学技术的不断发展，出现了多种测定基因组大小的方法，如流式细胞术、荧光定量分析法、孚尔根染色-显像密度计法、孚尔根染色-图像分析法等，其中流式细胞术是一种利用激光束散射与折射原理来对液体中的细胞或其他微小颗粒状物体进行快速分析与分选的技术，可以高通量分析上万个细胞，具有速度快、精度高、准确性好的优点[4]，它近年来常被用来测定DNA 的含量[5-8]。而碘化丙啶(propidium iodide,PI)是一种常用的插入性核酸染料，可均匀地嵌入单链或双链核酸分子，且没有明显的碱基选择性，常用于核酸定量分析[9]。在激发光的激发下，流式细胞仪可检测到PI 发出的荧光，由于PI 在着色过程中的嵌入量与DNA 的量成正比，因而用荧光强度可以表示DNA 的相对含量。通过测定待测样品和标准样品的PI 发射荧光强度，便可得知待测样品细胞的DNA 含量和标准样品细胞的DNA 含量之间的比例关系[7]，从而计算出待测样品的DNA 含量。

流式细胞术测定动物基因组常采用鸡Gallus domesticus 红细胞作为对照标准样品，但流式细胞仪所用鸡红细胞通常需采集活鸡血液制备获得，制备步骤繁琐，储存时间短，使用成本高。人Homo sapiens 白血病HL60 细胞易于实验室培养，能持续增殖，很多生物实验室均有保存，使用成本低，而流式细胞术以人的白血病HL60 细胞为对照标准尚未见报道，另外泽陆蛙基因组大小也未见报道。本文采用流式细胞术，首次以人白血病HL60 细胞为对照，测定和分析了泽陆蛙的基因组大小，为该物种基因组学后续研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验用泽陆蛙样本于2019 年8 月，采自浙江舟山群岛，使用GPS 仪记录每个采样点的经纬度信息(表1)。泽陆蛙样品采集后记录有明确表型特征的信息，并对采集到的样品进行物种鉴定[10]。泽陆蛙的性别根据雄性个体较雌性个体的第一指婚垫发达，雄性个体具单咽外声囊，咽喉部为黑色，具有雄性线，而进行鉴别。

表1 泽陆蛙样本采集信息Tab.1 Samples collection information of F.limnocharis

标准样品人白血病HL60 细胞，本实验室培养保存；EDTA 抗凝管(美国BD 公司)；碘化丙锭(美国Sigma 公司)；RNase(大连TAKARA 公司)；聚乙二醇辛基苯基醚(Triton-X-100)(上海生工公司)；其它试剂均为国产分析纯。PBS 缓冲液(137 mmol·L-1NaCl，2.7 mmol·L-1KCl，10 mmol·L-1Na2HPO4，2 mmol·L-1KH2PO4，pH 7.4)，碘化丙锭PI 染液(100 mL 染液含PI 5 mg，RNase 2 mg，Triton-X-100 1 mL，柠檬酸钠100 mg，PBS缓冲液定容，pH 7.2～7.4)。

1.2 主要仪器

ACEA NovoCyte 流式细胞仪(美国安捷伦公司)；5804R 台式离心机(德国Eppendorf 公司)。

1.3 分析软件

NovoExpress v1.3.3 软件(美国安捷伦公司)；Excel 2010(美国微软公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 蛙红细胞悬液的制备

选取健康雌性泽陆蛙个体，用注射器取新鲜蛙血0.2～0.5 mL 注入含乙二酸四乙酸二钠(EDTA-Na2)的抗凝管中，加入1 mL PBS 缓冲液冲打数次，用400 目筛网过滤后以500 r·min-1离心5 min，分离出红细胞，弃上层液体，加PBS 缓冲液悬浮后以相同速度离心5 min，弃上清，加入0.3 mL PBS 缓冲液重悬浮细胞。

1.4.2 细胞固定和染色

取蛙红细胞悬液和HL60 细胞样品，与冰乙醇以1:3 的比例混合，使乙醇终质量分数为75%，在4 ℃冰箱固定保存1 h。染色前，将固定好的细胞以1 000 r·min-1离心15 min，沉淀用PBS 缓冲液洗涤后以1 000 r·min-1离心，重复3 次。蛙红细胞样品和HL60 细胞样品分别加入0.6 mL 和0.8 mL 碘化丙锭PI 染液，在37 ℃下避光染色20 min。

1.4.3 流式细胞仪检测

将染色后的蛙红细胞悬液和HL60 细胞标准品以1:1 的比例混合(红细胞和HL60 细胞各取0.2 mL 混合)，并保留单独的HL60 细胞和蛙红细胞样品各一份作为对照(对照组均为0.4 mL)，用400 目筛网过滤除去悬浮物。用流式细胞仪检测DNA 含量，先用488 nm 的蓝光激发，然后以625±10 nm 的发射波长检测PI的发射荧光。实验采用同批的白血病细胞标准样品和相同的实验环境，每组样品至少收集10 000 个细胞，最大限度保证实验中各个样品的均衡性。

1.4.4 图像制作与数据分析

测量所得的图像和数据用仪器自带软件NovoExpress v1.3.3 进行显示和分析。在仪器采集和测定样品后，在软件内创建散点图，在得到的散点图上设置门限(setgate)E1 使其只显示该门内的事件，排除破碎的细胞对实验数据的干扰；再在门内事件的基础上创建对应的密度图和散点图以反映所选取细胞的荧光情况，对密度图中设置门限P3，以排除粘连的细胞；最后在门限P3 范围内做出反映泽陆蛙红细胞样品与人白血病细胞标准样品荧光强度对比的柱状图，得到实验数据。

1.4.5 基因组大小计算

本研究通过比较白血病细胞标准样与泽陆蛙红细胞样品荧光强度的倍数关系,计算泽陆蛙的基因组大小。依据如下公式计算：

泽陆蛙的基因组大小=HL60 细胞基因组大小×蛙红细胞PI 荧光强度/HL60 细胞荧光PI 强度(HL60 细胞基因组大小为2.92 Gb)。

泽陆蛙的基因组重量(2C)=泽陆蛙基因组大小/0.978(1 pg 基因组相当于0.978 Gb)

本研究共测定5 组样品，并用Excel 2010 进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 样品测定

通过测定得到了图像和数据(图1)，以第一组样品为例。图1A 显示泽陆蛙的红细胞样品与人白血病HL60 细胞标准样品各自对应的粒子团有少部分重叠，但仍可有效分开，说明用HL60 细胞作内标计算蛙红细胞基因组大小是可行的；图1B 是在A 图E1 门限范围内(占A 图中所有粒子总数的69.40%)所测出的蛙红细胞与HL60 细胞样品荧光情况，其中P3 门限范围内(占B 图中所有粒子总数的68.36%)的为分散细胞发出的荧光，荧光集中且强度高，可用于下一步测定计算，P3 正上方的是因细胞粘连而呈现的多个荧光团，不可用于测定计算；C 图也是在E1 范围内选出的泽陆蛙红细胞样品与人白血病细胞标准样品的荧光散点图，结果显示已排除破碎的细胞对之后荧光强度测定的干扰；D 图是P3 范围内的样品荧光信号强度柱状图，结果显示蛙红细胞峰状图与HL60 虽相距较近但也能有效分开，靠右的HL60 细胞因有部分正在进行分裂而呈现2 个峰，但只取第一个峰的数据进行计算，所以并不会影响测定效果。

图1 蛙红细胞样品和标准样品HL60 混合后的流式细胞术测定结果Fig.1 Flow cytometry measurement result of red blood cell and standard sample HL60 mixed

2.2 泽陆蛙基因组大小分析

以人白血病细胞作为标准参照，用流式细胞仪测定泽陆蛙的基因组大小，所得的检测结果如图2 所示。AB 图分别为2 次实验的结果，横坐标表示荧光信号，纵坐标表示检测的细胞数目，以标定相同的细胞数来比较2 组的荧光强度。根据测定的结果计算出基因组大小(表2)，泽陆蛙基因组DNA 质量为2.21±0.17 pg，基因组大小为2.16±0.16 Gb。

表2 流式细胞术测定的泽陆蛙C-值、基因组重量与基因组大小Tab.2 Determination on C-value,genomic DNA quality and genome size of F.limnocharis

图2 泽陆蛙5 个雌性样本红细胞基因组大小的流式细胞术测定Fig.2 Genome size determination on five female individuals of F.limnocharis using flow cytometry

3 讨论

在已有的动物基因组数据库中，测定C-值使用最多的方法是孚尔根染色-显像密度计法，其次是流式细胞仪术，由于流式细胞术不需要制备细胞核悬液，样品制备简单，检测快速，结果准确，使得流式细胞术已逐渐成为替代孚尔根染色-显像密度计法的测定方法。不同的流式细胞术研究使用的对照标准并一致，也没有规定的统一标准，通常理想的DNA 对照标准品要求是分散系细胞的均一细胞群，测定时具有完美峰型，与待测物种基因组大小相近又能够相互区分、遗传稳定、基因组大小数据可靠且容易获得。动物基因组测定经常采用鸡红细胞作为对照标准样品，也有人采用人淋巴细胞作为标准样品[3]，但上述标准品制备难度较大，多依赖购买进口成品，使用成本高，而本研究首次采用了人的白血病HL60 细胞作为对照标样。HL60 细胞为早幼粒细胞，是适用于DNA 含量测定的对照标准[11]，也便于使用荧光光谱等技术，而且取材方便，已有的基因组学数据可靠，易于实验研究。根据本实验的流式细胞术测定结果，HL60 细胞与泽陆蛙红细胞基因组大小相近，而DNA 差异较大，粒子团重叠较少(图1A)，证明科研上广泛使用的白血病肿瘤细胞HL60 可以作为对照标准样估算两栖动物基因组大小。

两栖类动物的体细胞染色体数和DNA 含量基本是恒定不变的，因此C-值可作为两栖类动物的一个特性参数。已有的研究表明，基因组的大小与生物体的许多生理特征有一定的相关性，如细胞大小[12]、代谢率和发育速度[13-14]等，近来有研究者发现在两栖动物神经细胞的发育与基因组大小高度相关，基因组和细胞大小的增加会导致神经(以及非神经)组织的发育速度减慢，从而导致在“幼体发育”的背景下形态的二次简化，并认为两栖动物和肺鱼大脑的形态复杂性在很大程度上受基因组大小和细胞大小的影响[15]。同时基因组大小也可作为种质鉴定、系统分类和物种进化等研究的参考数据。

两栖动物是一个古老的动物类群，是脊椎动物从水生到陆生进化的过滤类群和重要分支，已经演化出复杂的进化支系，展现出形态的千姿百态，不同种类个体大小差异巨大的特征。目前仅完成极少数两栖类物种的基因组测序，多数物种的基因组大小仍是未知，这在一定程度上限制了人们对两栖动物基因组特性与演化的认识。然而个体大小与基因组大小并没有直接相关的关系，基因组大小不但是重要的基因组特征，也是基因组组装测序前必须要了解的参数。在已知的基因组数据库中，不同种类的蛙基因组大小相差较大，如草莓箭毒蛙Oophaga pumilio 个体很小，但基因组大小为6.76～9.0 Gb[16]，高山倭蛙Nanorana parkeri基因组大小为2.01 Gb，非洲爪蟾Xenopus laevis 的基因组大小为1.50 Gb[17]，非洲牛蛙Pyxicephalus adspersus的基因组大小为1.53 Gb[18]，美国牛蛙Rana (Lithobates) catesbeiana 的基因组大小为6.10 Gb[19]，巨型海蟾蜍Rhinella marina 的基因组大小为2.49 Gb[20]，热带非洲爪蟾Xenopus tropicalis 的基因组大小为1.41 Gb[21]，本文测定计算得出的泽陆蛙基因组略小于高山倭蛙基因组大小。这些蛙近亲种之间的基因组大小差异较大，这种差异可能与其所处环境因子稳定性和对环境的适应性有关。两栖类的基因组大小可以高出鸟类几倍甚至是十几倍，与鸟类和哺乳类相比高度可变，这可能与两栖动物复杂的支系与漫长的演化历史有关。两栖动物的基因组大小的演化过程是一个需深入探究的重要科学问题。

4 结论

我们研究表明可以选择白血病细胞为对照，应用流式细胞术估算两栖动物的基因组大小。泽陆蛙的基因组大小约为2.16±0.16 Gb，跟多数蛙类基因组大小相似，研究结果丰富了泽陆蛙的细胞遗传学数据，为研究其代谢发育、物种进化、物种分类以及养殖育种提供了科学基础，也为泽陆蛙的全基因组测定提供重要的技术参考，为泽陆蛙基因组学后续研究提供数据支持。