通过自噬调控细胞衰老的研究进展

薛 嘉， 谢晓刚， 康 健， 盘 婕， 权富生*

(1.西北农林科技大学动物医学院/农业部动物生物技术重点实验室，陕西杨凌 712100；2.陕西省动物疫病预防控制中心，陕西西安 710000；3.杨凌职业技术学院动物工程分院，陕西杨凌 712100)

细胞衰老是指细胞在执行生命活动过程中，随着时间的推移，细胞增殖与分化的能力和生理功能逐渐发生衰退的变化过程。细胞衰老被视为细胞处于永久性的生长停滞状态，不能重新进入细胞周期。自噬(autophagy)是细胞内受损物质的清除机制之一，能够维持细胞代谢平衡，并参与细胞衰老相关的各种生理病理过程。随着自噬相关研究的深入，越来越多的证据表明自噬在延缓细胞衰老方面发挥重要作用。通过改善细胞自噬水平，从而延缓细胞衰老已成为一个热点科学问题，受到各国学者的高度重视，对细胞遗传资源保护以及改善与衰老相关疾病都具有重要意义。

1 细胞衰老相关研究

细胞衰老是细胞生长发育的必然过程。细胞衰老后形态变大，增殖能力减弱，细胞周期停滞，清除能力降低，代谢物过度积累。目前细胞衰老相关的研究很多，如端粒变化、DNA甲基化改变、自噬等。Matsumoto C等[1]的研究发现，端粒长度反映细胞的复制潜能，其与细胞寿命密切相关。正常情况下，随着细胞分裂，端粒长度会逐渐缩短。当端粒缩短到一定程度时，导致细胞内基因组无法维持稳定状态，细胞就会出现生长停滞，最终导致细胞衰老和死亡。Lopes等的研究阐述了细胞衰老与DNA甲基化的关系，细胞在衰老过程中伴随着众多表观遗传修饰的变化，如组蛋白H4K20、H3K4高度甲基化，H3K9、H3K27低度甲基化等。研究表明，细胞中5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，5mC)总含量降低，有可能引起染色体的结构不稳定和重排，使其出现衰老状态[2]。增强细胞自噬水平可以延长寿命已在个体水平得到验证，如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)、黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)[3]等。近年来，通过改变自噬水平调节细胞衰老的方式受到广泛关注。降低哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)活性能增加自噬通量，促进线粒体逆行信号传导，增强线粒体膜电位，减少内部的活性氧，并延长人成纤维细胞的寿命。Ho T T等[4]在自噬减弱的造血干细胞(hematopoietic stem cells，HSCs)中观察到明显的衰老现象。关于自噬与细胞衰老的研究也将是一个长期探索的过程。

2 细胞自噬相关研究

自噬是1962年由Ashford和Porten首次提出的一种细胞内“自己吃自己”的现象，是一个动态的多阶段、多种基因共同参与调控的生理过程。细胞自噬是指胞质内形成自噬体或自噬溶酶体，降解损伤的细胞器、蛋白质等成分，以满足细胞自身的代谢需要。从酵母到人类，几乎所有真核生物正常的细胞都能通过低水平自噬维持自身功能的稳定。但在细胞需要营养和能量时，比如出现饥寒、氧化应激、生长因子缺乏，细胞内出现过多受损细胞器或代谢废物，细胞内自噬水平会迅速出现上调，清除受损的细胞器及蛋白，促进机体稳定性的恢复。

自噬的形成包括四个阶段，即自噬泡(phagophore)的发生、自噬体(autophagosome)的形成、自噬(fusion)的转运融合、自噬的降解(degradation)[5]。迄今为止已发现真核生物中存在30多种自噬相关基因(autophagy related gene，Atg)，其中参与自噬发生过程的主要有Atg1-10、Atg12-14、Atg16-18、Atg29、Atg31、Atg101等。1956年，Clark等在新生小鼠(Musmusculus)肾组织中观察到细胞中含有大量具有膜性结构的致密体，而且其中常含有类似于线粒体的胞质结构。1962年，Porter K R教授团队在美国洛克菲勒研究中心首次发现了自噬过程。1963年，de Duve C将自噬定义为细胞中存在包裹细胞质和细胞器的膜泡发生的现象。20世纪90年代，Ohsumi Y在酵母细胞中观察到了自噬小泡的大量累积，并进一步发现了一种自噬关键基因atg1，首次在分子水平上对自噬现象进行了解释。Klionsky D J等将细胞自噬的研究从酵母扩展到动植物、人类的细胞[6]。2016年Ohsumi Y教授的研究小组报道了细胞自噬的启动机制[7]。同年，诺贝尔生理学或医学奖颁给了Ohsumi Y教授，以表彰他为自噬机制的研究所做出的突出贡献。

3 细胞衰老与自噬的关系

3.1 自噬对细胞衰老的影响

自噬与细胞衰老是当前研究的热门课题，特别是调节细胞自噬水平已成为一个前瞻性的抗衰老策略。研究显示，自噬现象广泛存在于机体的各种生理状态中，尤其与衰老密切相关[8-9]。随着年龄的增长，细胞衰老过程通常也伴随着细胞自噬水平的减弱，对受损细胞器和蛋白的降解能力降低，同时自噬水平的降低可加速衰老进程[10]。适度激活细胞自噬具有抗衰老作用，通过提高自噬水平对许多模型生物的寿命具有延长作用。Pyo J O等[11]研究表明，在小鼠胚胎成纤维细胞中过表达自噬相关蛋白Atg5(autophagy protein 5)，改善了衰老相关特征，例如瘦体型、胰岛素敏感性增强、运动能力提高等，延长了小鼠寿命。2019年，Kim C等[12]的研究显示，在人胎盘间充质干细胞(human placenta derived mesenchymal stem cells，hPMSCs)中抑制缺氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)介导的氨酰tRNA合成酶复合多功能相互作用蛋白3(aminoacyl tRNA synthetase complex interacting multifunctional protein 3，AIMP3)，可以通过诱导自噬延缓干细胞的衰老。

3.2 细胞衰老与自噬过程中的共同信号通路

自从发现自噬对细胞衰老具有调控作用，研究人员开始进一步探讨调控自噬和衰老的信号通路之间是否存在联系。目前研究最多的细胞衰老相关信号通路有p53-p21WAF-1/Cip-1-pRb和p16INK4a-pRb通路，沉默信息调节因子1(silent information regulator 1，SIRT1)通路，mTOR通路等。p53、p21、p16、SIRT1及mTOR等蛋白是衰老相关信号通路中的重要分子，参与细胞衰老过程。

自噬与衰老过程都是由多条信号通路共同介导完成，其中mTOR、SIRT1以及p53等是多条信号通路的交叉点，是调控二者的关键蛋白。在这一调控过程中，哺乳动物mTOR及其相关信号途径发挥了重要作用。其中，涉及腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated poteinkinase，AMPK)/mTOR通路、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/丝氨酸-苏氨酸激酶(serine-threonine kinase，Akt)/mTOR通路等。研究显示，调控这些信号途径的关键信号分子可以调控衰老。

3.2.1 mTOR参与衰老和自噬 雷帕霉素靶蛋白(TOR)于1991年在酵母中被发现，与酵母TOR结构和功能相应的哺乳动物TOR称mTOR，TOR的基因序列从酵母到哺乳动物都十分保守，在氨基酸水平具有95%的同源性。mTOR是一种丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，也是哺乳动物雷帕霉素的靶蛋白。目前普遍认为，mTOR是调节细胞衰老和自噬通路的汇合点。mTOR作为细胞自噬的重要负调控因子，可通过上游信号因子的调节引起自身活性的变化，并通过调节下游复合物Atg1/ULK的生成诱导细胞自噬[13]。mTOR可形成两种不同的复合体mTORC1和mTORC2，其中mTORC1对能量、生长因子和雷帕霉素极度敏感。mTORC1复合体还可以通过磷酸化使ULK/Atg1失活，直接抑制自噬。mTORC2可调节细胞生存和细胞骨架，间接调节自噬，它对雷帕霉素瞬时作用并不敏感，但长期作用会破坏mTOR结构[13]。mTOR是通过直接磷酸化蛋白调节代谢与自噬，抑制mTOR信号通路能快速诱导自噬。Houssaini A等[14]探讨了mTOR信号通路在慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)的肺细胞衰老中的潜在作用，研究表明细胞衰老与mTOR活化有关，通过低剂量的雷帕霉素抑制mTOR，能够阻止细胞衰老并抑制炎症反应。

3.2.2 SIRT1参与衰老和自噬 SIRT1是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)依赖的Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)，俗称长寿基因，是衰老相关信号通路中的重要分子，参与细胞衰老过程。SIRT1主要分布在细胞核中，其功能是催化组蛋白赖氨酸ε-位的氨基去乙酰化，使基因组DNA链能够紧密缠绕在一起，维持染色体结构稳定，达到基因沉默的作用。SIRT1在多种生物中有广泛表达且具有高度保守性，在抵抗氧化应激和延长细胞寿命方面起着重要作用[15]。

研究发现，STRT1可以通过调控自噬延缓细胞衰老。SIRT1在原代小鼠胚胎成纤维细胞中的过表达能够延缓细胞衰老。研究还发现，SIRT1与自噬机制中的一些必需成分相互作用，如SIRT1与自噬蛋白Atg5、Atg7和Atg8的去乙酰化有关。Lim C M等[16]的研究表明，Aquatide能够激活SIRT1从而调控自噬，有助于抑制紫外线照射引起的人真皮成纤维细胞衰老。Liu T等[17]研究发现，SIRT1通过增强自噬来逆转衰老，并促进p53降解以减弱氧化应激诱导的细胞凋亡。

3.2.2 p53参与衰老和自噬 p53是细胞衰老与自噬的共同调控蛋白，在衰老与自噬过程中发挥重要作用。研究发现，携带p53活性片段的转基因小鼠表现出衰老症状，可能是由于细胞自噬受到抑制；携带完整的p53及其等位基因和Arf的转基因小鼠，能够激活p53的表达，使p53表达适度增加，表现出衰老延迟。由此推测，诱导p53在特定位置的适度过表达能够抑制mTOR，激活自噬；而p53的过度表达，反而抑制自噬，表现出衰老症状。最近研究表明，适度增加p53活性能够延长细胞寿命，p53对细胞衰老具有双重作用与其对mTOR的负性调节有关。也有研究证实p53与多种自噬相关蛋白如Agt10和Agt7等的表达有关。p53诱导p21表达会使细胞周期阻滞，引起细胞衰老，但随着p53的大量积累，其对mTOR的抑制作用逐渐增强，细胞转变为可逆的阻滞状态[18]。

4 药物通过自噬调控细胞衰老

运用影响上述信号通路的药物诱导自噬延缓细胞衰老是一个值得研究的方向，近年来得到了广泛关注。许多自噬诱导剂被认为具有抗衰老作用，例如mTOR抑制剂，如雷帕霉素；组蛋白脱乙酰化酶激活剂，如白藜芦醇；组蛋白乙酰化酶抑制剂，如亚精胺及其他多胺化合物(精胺和腐胺)等。这些自噬诱导剂在抗衰老方面具有一定的运用前景，其中一些正被深入研究。

4.1 雷帕霉素抗衰老相关研究

雷帕霉素(rapamycin)是20世纪70年代初由加拿大Ayerst研究所从放线菌培养液中分离出来的大环内酯类抗生素。开始时作为低毒性的抗真菌药物，直到1997年发现其具有免疫抑制活性，被美国食品与药物管理局(Food and Drug Administration，FDA)批准作为免疫抑制剂应用于肾移植[19]。20世纪90年代中期，研究发现其对T淋巴细胞增殖具有抑制作用，又将其用于抗肿瘤细胞治疗。目前，雷帕霉素是一种主要用于器官移植的新型大环内酯类免疫抑制剂。研究发现，雷帕霉素能够诱导细胞发生自噬作用，在体内和体外通过抑制靶蛋白mTOR激酶的活性从而激活细胞自噬[20]，最终抑制或逆转体外细胞衰老和延长动物寿命[21]。因此，应用雷帕霉素激活自噬延缓细胞衰老已成为当前抗衰老研究的热点问题。

最初在酵母中进行雷帕霉素调节寿命的研究，用雷帕霉素处理酵母细胞，发现雷帕霉素通过抑制TORC1信号通路，从而延长其寿命。后续研究发现，雷帕霉素能够延长酿酒酵母(S.cerevisiae)、秀丽隐杆线虫(C.elegans)、黑腹果蝇(D.melanogaster)等生物的生命期[22]。Xia等人研究结果表明，雷帕霉素通过抑制mTOR可以在一定程度上减缓人牙龈成纤维细胞的衰老，恢复老化的牙龈，并缓解炎症。Han等的研究显示，将人类包皮成纤维细胞(Hs68细胞)传代至它们达到细胞衰老，细胞内自噬水平有所减弱。此外，在体外培养细胞过程中，从第29代开始连续向细胞培养基中加入雷帕霉素以诱导自噬，当传代至第40代时细胞仍未出现衰老表型，表明雷帕霉素能够延缓细胞衰老[23]。Sodagam L等[24]的研究显示，慢性雷帕霉素暴露和间歇性血清饥饿能在体外延缓人成纤维细胞的衰老。Lesniewski L A等[25]研究显示，饲喂雷帕霉素对老年小鼠动脉功能具有改善作用，导致氧化应激减少、AMPK激活、参与细胞周期调控的蛋白表达增加，从而延缓衰老。Wang R等[26]发现，雷帕霉素通过Nrf2非依赖性机制抑制衰老细胞的分泌表型从而延缓衰老。Gao C等[27]研究发现，雷帕霉素可以抑制纤维环细胞的分化和衰老，对椎间盘退行性疾病有着潜在治疗作用。Gidfar等人发现，雷帕霉素用于人角膜上皮细胞(hunman corneal epithelial cell，HCEC)可防止角膜上皮干/祖细胞衰老和凋亡。Qin D等[28]研究显示，雷帕霉素通过抑制活性氧的产生来保护皮肤成纤维细胞免受紫外线B诱导的光老化。通过抑制mTOR活性来延长寿命具有科学性，也具有潜在的医学应用价值，但免疫抑制剂雷帕霉素在人类临床的实际应用中仍然存在问题。

4.2 白藜芦醇抗衰老相关研究

白藜芦醇(resveratrol)是一种天然非黄酮类多酚化合物，存在于红葡萄酒、草莓和坚果等中。1939年，高冈首次从白藜芦(Veratrumalbum)中分离出白藜芦醇。研究表明，白藜芦醇具有抗氧化、抗炎、抗衰老和抗肿瘤等多种生物学活性。白藜芦醇抗衰老作用在酿酒酵母(S.cerevisiae)、秀丽隐杆线虫(C.elegans)、黑腹果蝇(D.melanogaster)和人类免疫细胞中也得到了验证。白藜芦醇也是一个有效的自噬调节剂，通过调控自噬相关信号通路对不同细胞发挥作用。目前认为，这些作用与激活SIRT1有关[29]。已有研究证明SIRT1过表达会延缓细胞衰老并延长其寿命[30]，而抑制SIRT1会导致细胞衰老。也有研究显示白藜芦醇可促进氧化应激以驱动癌细胞中肝癌缺失基因1(deleted in liver cancer-1，DLC1)介导的细胞衰老[31]。白藜芦醇不仅能通过激活SIRT1调控细胞衰老与自噬，还能通过抑制雷帕霉素的靶蛋白mTOR发挥作用[32]。

研究表明，白藜芦醇能够逆转高脂肪高蔗糖饮食诱导的大鼠主动脉衰老过程。白藜芦醇通过抑制人真皮成纤维细胞中复制衰老标记物INK4a的表达，延缓细胞衰老。白藜芦醇通过结合衰老细胞中变异的人体蛋白Lamina，活化SIRT1，增加干细胞数量，从而延缓衰老过程[33]。Chang Y C等[34]的研究显示，白藜芦醇通过改善自噬通量保护肌肉细胞免受棕榈酸盐诱导的细胞衰老和胰岛素抵抗。Shen X等[35]的研究显示，白藜芦醇通过PPAR-α/HO-1途径可减少内皮祖细胞(endothelial progenitor cell，EPC)的氧化反应并抑制其衰老。Wang等研究显示，白藜芦醇通过激活ROS介导的PI3K/Akt通路，抑制高糖诱导的髓核细胞凋亡和衰老。Sgarbi G等[36]的研究显示，白藜芦醇在人有丝分裂后的细胞模型中保留线粒体功能从而影响细胞衰老过程。白藜芦醇虽然能够激活Sirtuin蛋白，但同时也能影响其他蛋白活性，其作用机制远未明确。此外，白藜芦醇发挥抗衰老作用与其浓度有关，抑制细胞衰老的能力因证据较少也存在争议。

4.3 亚精胺抗衰老相关研究

亚精胺(spermidine)是在地中海和亚洲饮食中发现的高浓度天然化合物，它是一种丰富的天然多胺，存在于从细菌到人类的所有生物体中。在生物体内，亚精胺浓度随着年龄的增长而降低。亚精胺具有多效作用，包括抗炎、抗氧化、增强线粒体呼吸和代谢功能，以及改善蛋白质稳态和分子伴侣活性。亚精胺的抗衰老作用与其诱导细胞保护性自噬的能力有关。额外添加的亚精胺以自噬依赖的方式延长物种寿命，并抵消与年龄相关的有病理学改变的疾病，例如心血管疾病、神经变性和癌症。Eisenberg T等[37]研究显示，多胺亚精胺已被确定为一种有效的特异性自噬诱导剂。在酿酒酵母(S.cerevisiae)、黑腹果蝇(D.melanogaster)[38]等中观察到亚精胺能够诱导自噬。自噬缺陷的黑腹果蝇(D.melanogaster)在亚精胺处理后没有表现出寿命延长，表明自噬对于亚精胺调控寿命是不可或缺的。

亚精胺对自噬的诱导与mTOR通路无关，它是通过影响蛋白质的乙酰化水平发挥作用。有研究证实，小鼠口服补充天然多胺亚精胺增强了心脏自噬、线粒体自噬和线粒体呼吸[39]。Chrisam M等[40]研究显示，在Col6a1基因敲除小鼠中全身施用亚精胺以剂量依赖性方式可重新激活自噬，改善Ⅵ型胶原缺失小鼠的肌源性缺损。亚精胺能够使组蛋白H3发生去乙酰化作用，上调自噬相关基因的表达，增强自噬活性，从而延缓多种细胞的衰老进程[37]。Yue F等[41]研究表明，亚精胺通过激活MAP1S介导的自噬作用来延长寿命和预防肝纤维化和肝癌。LaRocca T J等[42]通过给动脉受损的老年小鼠补充亚精胺，观察到细胞自噬活性增强，自噬标志物表达水平恢复，受损动脉功能得到改善，为通过自噬改善机体功能的可能性提供支持。还有研究表明，使用自噬诱导化合物亚精胺可以显着调节T细胞功能，改善老年免疫力[43]。Zhu W W等[44]研究显示，亚精胺能够通过上调CB1受体表达，抑制高糖诱导的HT-22细胞衰老。Fan J等[45]研究显示，亚精胺与运动相结合可以通过增强自噬水平，减少AMPK-FOXO3a信号通路介导的细胞凋亡，从而预防或治疗D-gal诱导的衰老相关的骨骼肌萎缩。许多研究表明亚精胺能够延缓细胞衰老，然而尚未明确其是否直接参与调控自噬发生，相关临床研究也相对较少，同时亚精胺添加量也不明确。因此，需要对亚精胺的临床应用进行进一步探索。

5 结语

细胞培养过程中发生衰老是一个不可避免的现象，细胞衰老可导致细胞功能减退和细胞活性下降。在核移植研究中，衰老细胞作为供核细胞，核移植效率会明显下降；在动物转基因研究中，衰老细胞外源基因转染效率下降并影响细胞增殖和生长。所以，延缓细胞衰老有利于转基因阳性克隆细胞的筛选及生产健康的转基因克隆动物，有利于通过iPS等手段实现组织再生，还有利于细胞种质资源的保存和应用。近年来的研究表明，细胞自噬对于细胞衰老进程具有调节作用，适度激活自噬能够延缓细胞衰老。因此，利用细胞自噬来改变细胞衰老状态将是未来科学研究的重点，也可为治疗衰老相关疾病、延长生物体寿命提供新的方向。虽然研究表明自噬和衰老密切相关，但目前仍不能完全阐明两者之间的交互作用。许多自噬诱导剂的具体作用机制仍未完全阐明，如何在实际应用中更加合理地开发利用也有待进一步深入研究。